一、引言

二、RNAi 和電穿孔技術(shù)的原理

（一）RNAi 的作用機(jī)制

1. 基因沉默的原理

• RNAi 是一種通過小 RNA 分子（如 siRNA 和 miRNA）來特異性地抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制。這些小 RNA 分子與靶基因的 mRNA 結(jié)合，引導(dǎo) RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）對 mRNA 進(jìn)行切割或抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。

• RNAi 具有高度的特異性和有效性，可以在細(xì)胞內(nèi)精確地調(diào)控特定基因的表達(dá)水平。

2. RNAi 在基因功能研究中的優(yōu)勢

• 在基因功能研究中，RNAi 可以快速、有效地降低特定基因的表達(dá)，從而觀察其對細(xì)胞或生物體生理過程的影響。與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，RNAi 具有操作簡便、成本低、時間短等優(yōu)點(diǎn)。

• 此外，RNAi 可以同時抑制多個基因的表達(dá)，適用于大規(guī)模的基因功能篩選。

（二）電穿孔技術(shù)的原理

1. 細(xì)胞膜的電學(xué)特性與電穿孔

• 細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境的分隔屏障，具有一定的電學(xué)特性。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞膜對離子和大分子物質(zhì)的通透具有選擇性。然而，當(dāng)細(xì)胞處于外加電場環(huán)境中時，細(xì)胞膜兩側(cè)會產(chǎn)生電勢差，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成親水性孔隙，即電穿孔現(xiàn)象。

• 電穿孔技術(shù)利用這一原理，將外源物質(zhì)（如 RNAi 分子、質(zhì)粒 DNA 等）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

2. 電穿孔技術(shù)在基因?qū)胫械膽?yīng)用

• 在雞胚基因功能研究中，電穿孔技術(shù)可以將 RNAi 分子高效地導(dǎo)入雞胚細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對特定基因的沉默。通過調(diào)整電場參數(shù)，可以控制電穿孔的程度和效率，從而確保 RNAi 分子能夠有效地進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用。

• 此外，電穿孔技術(shù)還可以用于將其他基因調(diào)控工具（如質(zhì)粒 DNA 表達(dá)載體、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)等）導(dǎo)入雞胚細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對基因功能的更精確調(diào)控。

三、利用 RNAi 和電穿孔技術(shù)篩選雞胚基因功能的方法

（一）設(shè)計(jì)和合成 RNAi 分子

1. 確定靶基因

• 根據(jù)研究目的，選擇感興趣的雞胚基因作為靶基因。可以通過文獻(xiàn)檢索、生物信息學(xué)分析等方法確定潛在的功能基因。

• 同時，需要考慮靶基因的表達(dá)模式、生物學(xué)功能以及在雞胚發(fā)育中的作用。

2. 設(shè)計(jì) siRNA 或 miRNA 分子

• 根據(jù)靶基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異性的 siRNA 或 miRNA 分子。這些分子需要與靶基因的 mRNA 具有高度的互補(bǔ)性，以確保有效的基因沉默。

• 可以使用在線設(shè)計(jì)工具或?qū)I(yè)的軟件來設(shè)計(jì) RNAi 分子，并進(jìn)行序列優(yōu)化和驗(yàn)證。

3. 合成 RNAi 分子

• 一旦確定了 RNAi 分子的序列，可以通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄或使用表達(dá)載體等方法合成 RNAi 分子。化學(xué)合成的 RNAi 分子具有純度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但成本較高。

• 體外轉(zhuǎn)錄和表達(dá)載體合成的 RNAi 分子成本較低，但需要進(jìn)行純化和質(zhì)量控制。

（二）雞胚電穿孔操作

1. 雞胚準(zhǔn)備

• 選擇合適的雞胚發(fā)育階段進(jìn)行電穿孔操作。一般來說，早期雞胚（如 HH 階段 3-5）更容易接受外源物質(zhì)的導(dǎo)入，但此時基因的功能可能尚未顯現(xiàn)。晚期雞胚（如 HH 階段 10-15）基因功能更加明確，但電穿孔的難度可能會增加。

• 在進(jìn)行電穿孔操作之前，需要對雞胚進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，如去除蛋殼、消毒等，以確保操作的無菌性和安全性。

2. 電穿孔參數(shù)設(shè)置

• 根據(jù)雞胚的大小、細(xì)胞類型以及 RNAi 分子的特性，設(shè)置合適的電穿孔參數(shù)，包括電場強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。這些參數(shù)需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，以確保 RNAi 分子能夠有效地進(jìn)入雞胚細(xì)胞，同時最大限度地減少對雞胚的損傷。

3. 電穿孔操作步驟

• 將 RNAi 分子與適當(dāng)?shù)木彌_液混合，然后使用微注射器或其他工具將其注射到雞胚的特定部位（如神經(jīng)管、心臟、肢芽等）。接著，將電極放置在雞胚的兩側(cè)，施加電場脈沖，實(shí)現(xiàn)電穿孔。

• 在電穿孔操作過程中，需要注意操作的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，避免對雞胚造成不必要的損傷。

（三）篩選基因功能的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1. 單一基因沉默實(shí)驗(yàn)

• 首先進(jìn)行單一基因沉默實(shí)驗(yàn)，以確定每個靶基因的功能。將設(shè)計(jì)好的 RNAi 分子通過電穿孔技術(shù)導(dǎo)入雞胚細(xì)胞，然后觀察雞胚的發(fā)育過程和表型變化。

• 可以使用組織學(xué)分析、免疫組化、原位雜交等方法來檢測基因沉默后的雞胚組織形態(tài)、細(xì)胞類型、基因表達(dá)等變化，從而推斷靶基因的功能。

2. 多基因聯(lián)合沉默實(shí)驗(yàn)

• 為了進(jìn)一步研究基因之間的相互作用和功能網(wǎng)絡(luò)，可以進(jìn)行多基因聯(lián)合沉默實(shí)驗(yàn)。將多個 RNAi 分子同時導(dǎo)入雞胚細(xì)胞，觀察雞胚的表型變化和基因表達(dá)模式的改變。

• 通過比較單一基因沉默和多基因聯(lián)合沉默的結(jié)果，可以揭示基因之間的協(xié)同作用和冗余性。

3. 對照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

• 在基因功能篩選實(shí)驗(yàn)中，需要設(shè)置合適的對照實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對照實(shí)驗(yàn)包括陰性對照（如導(dǎo)入非特異性 RNAi 分子或不進(jìn)行電穿孔處理的雞胚）和陽性對照（如導(dǎo)入已知功能的 RNAi 分子或使用其他基因調(diào)控方法的雞胚）。

• 通過對照實(shí)驗(yàn)，可以排除非特異性效應(yīng)和實(shí)驗(yàn)操作誤差，準(zhǔn)確地判斷靶基因的功能。

四、RNAi 和電穿孔技術(shù)在雞胚基因功能研究中的應(yīng)用實(shí)例

（一）雞胚神經(jīng)管發(fā)育研究

1. 神經(jīng)管形成的關(guān)鍵基因

• 神經(jīng)管是雞胚發(fā)育過程中的重要結(jié)構(gòu)，其形成涉及多個基因的調(diào)控。通過利用 RNAi 和電穿孔技術(shù)，可以篩選出參與神經(jīng)管形成的關(guān)鍵基因。

• 例如，研究發(fā)現(xiàn)某些基因在神經(jīng)管閉合過程中起著重要作用，通過沉默這些基因，可以觀察到神經(jīng)管閉合缺陷的表型，從而確定其在神經(jīng)管發(fā)育中的功能。

2. 神經(jīng)管發(fā)育的信號通路

• RNAi 和電穿孔技術(shù)還可以用于研究神經(jīng)管發(fā)育的信號通路。通過沉默信號通路中的關(guān)鍵基因，可以觀察到神經(jīng)管發(fā)育的異常變化，從而推斷該信號通路在神經(jīng)管發(fā)育中的作用。

• 例如，研究發(fā)現(xiàn) Wnt 信號通路在神經(jīng)管背腹軸的形成中起著重要作用，通過沉默 Wnt 信號通路中的關(guān)鍵基因，可以觀察到神經(jīng)管背腹軸發(fā)育異常的表型。

（二）雞胚心臟發(fā)育研究

1. 心臟發(fā)育的關(guān)鍵基因

• 心臟是雞胚發(fā)育過程中的重要器官，其形成涉及多個基因的調(diào)控。利用 RNAi 和電穿孔技術(shù)，可以篩選出參與心臟發(fā)育的關(guān)鍵基因。

• 例如，研究發(fā)現(xiàn)某些基因在心臟瓣膜形成、心肌細(xì)胞分化等過程中起著重要作用，通過沉默這些基因，可以觀察到心臟發(fā)育異常的表型，從而確定其在心臟發(fā)育中的功能。

2. 心臟發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

• RNAi 和電穿孔技術(shù)還可以用于研究心臟發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過沉默多個基因，可以觀察到心臟發(fā)育的復(fù)雜變化，從而揭示基因之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

• 例如，研究發(fā)現(xiàn)某些基因在心臟發(fā)育過程中相互作用，共同調(diào)控心臟的形態(tài)發(fā)生和功能成熟。

五、結(jié)論