咨詢熱線
15532415159
追求合作共贏
Win win for you and me售前售中售后完整的服務(wù)體系
誠信經(jīng)營質(zhì)量保障價格合理服務(wù)完善無限增殖能力：ES 細(xì)胞能夠在體外長期培養(yǎng)過程中持續(xù)分裂增殖，且保持未分化狀態(tài)，為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和實驗研究提供了充足的細(xì)胞來源。
多向分化潛能：ES 細(xì)胞具有分化為三個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）所有細(xì)胞類型的能力，包括神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等，這使得它們在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
高核型穩(wěn)定性：ES 細(xì)胞在長期培養(yǎng)和傳代過程中能夠保持相對穩(wěn)定的染色體核型，這對于維持其生物學(xué)特性和遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。
表達(dá)特定的標(biāo)志物：ES 細(xì)胞表達(dá)一系列特異性的標(biāo)志物，如 Oct4、Sox2、Nanog 等轉(zhuǎn)錄因子，這些標(biāo)志物在維持 ES 細(xì)胞的未分化狀態(tài)和多能性方面發(fā)揮著重要作用，也是鑒定 ES 細(xì)胞的重要依據(jù)。
激活 Jak - Stat 信號通路：LIF 與 LIFR 結(jié)合后，導(dǎo)致受體相關(guān)的 Janus 激酶（Jak）磷酸化并激活。Jak 激酶隨后磷酸化 Stat3（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3），磷酸化的 Stat3 形成二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的 DNA 序列結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，這些基因參與維持 ES 細(xì)胞的未分化狀態(tài)和自我更新能力。
抑制分化相關(guān)信號通路：LIF 信號可以抑制一些促進(jìn) ES 細(xì)胞分化的信號通路，如 Wnt/β - catenin 信號通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路等。通過這種方式，LIF 維持了 ES 細(xì)胞的未分化狀態(tài)，使其在體外培養(yǎng)條件下能夠保持穩(wěn)定的多能性。
調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因：LIF 信號還可以影響 ES 細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而支持 ES 細(xì)胞的快速增殖。例如，LIF 可以上調(diào) cyclin D1 和 cdk4 等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從 G1 期進(jìn)入 S 期，加速細(xì)胞分裂。
ES 細(xì)胞培養(yǎng)
ES 細(xì)胞培養(yǎng)在含有特定營養(yǎng)成分和生長因子的培養(yǎng)基中，通常采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，以提供必要的細(xì)胞外基質(zhì)和生長信號，維持 ES 細(xì)胞的未分化狀態(tài)。培養(yǎng)基中還添加了 LIF、血清、非必需氨基酸、β - 巰基乙醇等成分。ES 細(xì)胞在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。
LIF 基因轉(zhuǎn)染
當(dāng) ES 細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)密度時，進(jìn)行 LIF 基因轉(zhuǎn)染。采用慢病毒感染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：首先，將慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到 293T 細(xì)胞中，包裝產(chǎn)生含有 LIF 基因的慢病毒顆粒。收集病毒上清液，經(jīng)過濃縮和純化后，將其加入到 ES 細(xì)胞培養(yǎng)體系中，并添加適量的聚凝胺（polybrene）以提高病毒感染效率。感染一定時間后，更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察 GFP 的表達(dá)情況，篩選出轉(zhuǎn)染成功的 ES 細(xì)胞，并進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增和培養(yǎng)。
LIF 基因轉(zhuǎn)染組：將攜帶 LIF 基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染到 ES 細(xì)胞中，獲得穩(wěn)定表達(dá) LIF 的 ES 細(xì)胞株，用于后續(xù)的生長和分化實驗。
空白對照組：未進(jìn)行任何基因轉(zhuǎn)染的 ES 細(xì)胞，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，作為對照，用于比較 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞特性的影響。
陰性對照轉(zhuǎn)染組：采用不含 LIF 基因的空載體慢病毒轉(zhuǎn)染 ES 細(xì)胞，以排除病毒載體本身對 ES 細(xì)胞生長和分化的影響。
細(xì)胞增殖分析
采用多種方法分析 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞增殖能力的影響。
MTT 法：定期將不同組的 ES 細(xì)胞接種到 96 孔板中，培養(yǎng)一定時間后，加入 MTT 試劑，繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時。然后，去除培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解甲臜結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀測定 490nm 處的吸光值，反映細(xì)胞的代謝活性和增殖情況。
BrdU 摻入法：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入 BrdU（5 - 溴 - 2 - 脫氧尿嘧啶核苷）標(biāo)記新合成的 DNA。培養(yǎng)一段時間后，收集細(xì)胞，通過免疫熒光染色檢測 BrdU 的摻入情況，從而評估細(xì)胞的增殖速率。利用流式細(xì)胞術(shù)對 BrdU 陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析，比較不同組 ES 細(xì)胞的增殖差異。
細(xì)胞計數(shù)法：定期對不同組的 ES 細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，直觀地觀察 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞增殖速度的影響。同時，計算細(xì)胞倍增時間，進(jìn)一步量化細(xì)胞的增殖能力。
自我更新能力檢測
堿性磷酸酶（ALP）染色：ALP 是 ES 細(xì)胞未分化狀態(tài)的一個重要標(biāo)志物，其活性在未分化的 ES 細(xì)胞中較高。對不同組的 ES 細(xì)胞進(jìn)行 ALP 染色，通過觀察染色強度和陽性細(xì)胞比例，評估 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞自我更新能力的影響。染色結(jié)果采用顯微鏡觀察并拍照記錄，采用圖像分析軟件對染色強度進(jìn)行定量分析。
實時熒光定量 PCR 檢測多能性基因表達(dá)：提取不同組 ES 細(xì)胞的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，采用實時熒光定量 PCR 技術(shù)檢測 Oct4、Sox2、Nanog 等多能性基因的表達(dá)水平。以 β - actin 作為內(nèi)參基因，通過比較不同組基因的相對表達(dá)量，分析 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞多能性維持的影響。
免疫熒光染色檢測多能性蛋白：利用免疫熒光染色技術(shù)檢測 Oct4、Sox2、Nanog 等多能性蛋白在 ES 細(xì)胞中的表達(dá)和定位。通過熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，比較不同組 ES 細(xì)胞中多能性蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗證 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞自我更新能力的影響。
分化潛能研究
體外定向分化實驗：將 LIF 基因轉(zhuǎn)染組和對照組的 ES 細(xì)胞分別誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等不同細(xì)胞類型，采用相應(yīng)的分化培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件進(jìn)行培養(yǎng)。在分化過程中，定期觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并通過免疫熒光染色、實時熒光定量 PCR 和 Western blot 等技術(shù)檢測分化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況，評估 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞多向分化潛能的影響。
體內(nèi)分化實驗：將 LIF 基因轉(zhuǎn)染的 ES 細(xì)胞和對照組 ES 細(xì)胞分別注射到免疫缺陷小鼠的體內(nèi)，形成畸胎瘤。一段時間后，取出畸胎瘤，進(jìn)行組織學(xué)分析，觀察畸胎瘤中是否包含三個胚層的組織類型，如神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)（代表外胚層分化）、肌肉組織（代表中胚層分化）和腺體組織（代表內(nèi)胚層分化）等。通過比較畸胎瘤中不同組織類型的比例和分化程度，評估 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞體內(nèi)分化能力的影響。
MTT 法結(jié)果顯示，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的吸光值明顯高于空白對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，表明其代謝活性增強，細(xì)胞增殖速度加快。隨著培養(yǎng)時間的延長，這種差異逐漸增大，說明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠持續(xù)促進(jìn) ES 細(xì)胞的增殖。
BrdU 摻入法和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，LIF 基因轉(zhuǎn)染組中 BrdU 陽性細(xì)胞的比例顯著高于對照組，說明更多的 ES 細(xì)胞處于 DNA 合成期，細(xì)胞增殖速率加快。定量分析顯示，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于空白對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，進(jìn)一步證實了 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
細(xì)胞生長曲線顯示，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞生長速度明顯快于對照組，細(xì)胞倍增時間縮短。這表明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠顯著提高 ES 細(xì)胞的增殖能力，使其在相同的培養(yǎng)條件下能夠更快地擴(kuò)增數(shù)量。
堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞呈現(xiàn)出較強的 ALP 染色陽性，染色強度明顯高于空白對照組和陰性對照轉(zhuǎn)染組，且陽性細(xì)胞比例也顯著增加。這表明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠增強 ES 細(xì)胞的 ALP 活性，維持其未分化狀態(tài)，提高細(xì)胞的自我更新能力。
實時熒光定量 PCR 檢測結(jié)果顯示，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞中 Oct4、Sox2、Nanog 等多能性基因的表達(dá)水平顯著高于對照組。這說明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠上調(diào)多能性基因的表達(dá)，維持 ES 細(xì)胞的多能性狀態(tài)，進(jìn)一步證實了其對 ES 細(xì)胞自我更新能力的促進(jìn)作用。
免疫熒光染色結(jié)果顯示，Oct4、Sox2、Nanog 等多能性蛋白在 LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞中表達(dá)豐富，且定位在細(xì)胞核中，與未轉(zhuǎn)染的 ES 細(xì)胞相比，蛋白表達(dá)水平明顯提高。這進(jìn)一步從蛋白水平驗證了 LIF 基因轉(zhuǎn)染對 ES 細(xì)胞自我更新能力的積極影響，表明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠有效維持 ES 細(xì)胞的未分化特性和多能性。
體外定向分化實驗結(jié)果表明，在誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等不同細(xì)胞類型的過程中，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞表現(xiàn)出更強的分化能力。例如，在神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞能夠更快地形成神經(jīng)樣細(xì)胞團(tuán)，并且表達(dá)更高水平的神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如 β - tubulin III、Nestin 等。通過實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá)水平在 LIF 基因轉(zhuǎn)染組中明顯高于對照組。在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化方面，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞能夠更早地出現(xiàn)自發(fā)搏動現(xiàn)象，并且表達(dá)心肌細(xì)胞特異性基因和蛋白，如 α - actin 等，其表達(dá)量也顯著高于對照組。在肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗中，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞能夠更有效地形成肝樣細(xì)胞集落，并表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如 Albumin、AFP 等，這些標(biāo)志物的表達(dá)水平同樣高于對照組。這些結(jié)果表明，LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠增強 ES 細(xì)胞的多向分化潛能，使其在體外更容易被誘導(dǎo)分化為各種特定的細(xì)胞類型。
體內(nèi)分化實驗結(jié)果顯示，將 LIF 基因轉(zhuǎn)染的 ES 細(xì)胞和對照組 ES 細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤后，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的畸胎瘤中包含了更豐富的三個胚層的組織類型，且各組織類型的分化程度更高。與對照組相比，LIF 基因轉(zhuǎn)染組畸胎瘤中的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)更加完整，肌肉組織更加成熟，腺體組織也更加發(fā)達(dá)。這進(jìn)一步證明了 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠提高 ES 細(xì)胞在體內(nèi)的分化能力，使其能夠更好地參與胚胎發(fā)育過程中的組織形成和分化。
Wnt/β - catenin 信號通路的抑制
研究發(fā)現(xiàn)，LIF 基因轉(zhuǎn)染組的 ES 細(xì)胞中 β - catenin 蛋白的核內(nèi)積累明顯減少，同時下游 Wnt 靶基因的表達(dá)水平也顯著降低。這表明 LIF 基因轉(zhuǎn)染能夠抑制 ES 細(xì)胞中的 Wnt/β - catenin 信號通路。Wnt/β - catenin 信號通路在 ES 細(xì)胞分化過程中起著重要的促進(jìn)作用，其抑制有助于維持 ES 細(xì)胞的未分化狀態(tài)。LIF 可能通過多種方式抑制 Wnt/β - catenin 信號通路，例如，LIF 可以上調(diào)一些 Wnt 信號抑制劑的表達(dá)，或者通過與 Wnt 信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，干擾其信號傳遞過程。
BMP 信號通路的調(diào)節(jié)
在 LIF 基因轉(zhuǎn)染的 ES 細(xì)胞中，BMP 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平也發(fā)生了改變。BMP 信號通路在 ES 細(xì)胞的自我更新和分化平衡中起著關(guān)鍵作用。LIF 可能通過調(diào)節(jié) BMP 信號通路中的受體表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性以及下游靶基因的表達(dá)，來影響 ES 細(xì)胞的分化潛能。具體機(jī)制可能涉及 LIF 與 BMP 信號之間的交叉對話和相互調(diào)控，進(jìn)一步的研究還需要深入探討這些分子之間的具體相互作用關(guān)系。
