一、引言

M2 受體作為一種重要的毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型，廣泛分布于心血管、平滑肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織器官，在調(diào)節(jié)心率、平滑肌收縮和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其功能異常與多種疾病，如心律失常、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）和阿爾茨海默病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，對(duì) M2 受體的研究一直是藥理學(xué)和生理學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

地黃是一種傳統(tǒng)的中藥材，其活性成分梓醇具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等。近年來(lái)，有研究提示梓醇可能與膽堿能系統(tǒng)存在相互作用，然而其對(duì) M2 受體的具體影響尚未完整明確。為了深入探究地黃梓醇在 M2 受體相關(guān)生理病理過(guò)程中的作用，本研究利用轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞模型進(jìn)行深入研究，旨在揭示梓醇對(duì) M2 受體功能和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

二、材料與方法

（一）細(xì)胞系與試劑

細(xì)胞系

選用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞。該細(xì)胞系具有易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰且可高效表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)和受體研究。

試劑

地黃梓醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度 > 98%）購(gòu)自專業(yè)化學(xué)試劑公司。培養(yǎng)基為 DMEM/F12（含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）。轉(zhuǎn)染試劑采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000，根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行操作。用于檢測(cè) M2 受體表達(dá)的抗體包括 M2 受體特異性一抗（兔抗人 M2 受體多克隆抗體）和相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗（山羊抗兔 IgG - FITC）。其他試劑如磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶 - EDTA 消化液等均為分析純。

（二）轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞模型的構(gòu)建

目的基因獲取

從含有人類 M2 受體基因的質(zhì)粒載體中通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增目的基因片段。設(shè)計(jì)特異性引物，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性和完整性。PCR 反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，包括合適的退火溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)，以獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的目的基因片段。

轉(zhuǎn)染與篩選

將 CHO 細(xì)胞接種于 6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至 70 - 80% 匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將擴(kuò)增得到的 M2 受體基因片段與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。按照一定比例將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻后置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)，加入含有 G418（一種抗生素，用于篩選成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。持續(xù)篩選約 2 - 3 周，期間定期更換含 G418 的培養(yǎng)基，直至形成穩(wěn)定表達(dá) M2 受體的轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞株。

（三）細(xì)胞培養(yǎng)與處理

細(xì)胞培養(yǎng)

將篩選得到的轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞株接種于 T25 培養(yǎng)瓶或 96 孔板、24 孔板等不同規(guī)格的培養(yǎng)器皿中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定接種密度。細(xì)胞培養(yǎng)于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中，使用 DMEM/F12 培養(yǎng)基，每 2 - 3 天更換一次培養(yǎng)基，保持細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

梓醇處理

將地黃梓醇標(biāo)準(zhǔn)品用 DMSO（二甲基亞砜）溶解配制成高濃度儲(chǔ)備液，然后用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。在細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度（如 80 - 90% 匯合度）時(shí)，加入不同濃度的梓醇溶液，設(shè)置多個(gè)濃度梯度（如 1μM、10μM、100μM 等）和對(duì)照組（僅加入等體積的 DMSO 溶劑）。處理時(shí)間分別為 24、48 和 72 小時(shí)，以觀察梓醇對(duì) M2 受體的短期和長(zhǎng)期影響。

（四）檢測(cè)方法

M2 受體表達(dá)檢測(cè) - Western blotting

收集經(jīng)梓醇處理和對(duì)照組的細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌兩次后，加入含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液，冰上裂解 30 分鐘。裂解產(chǎn)物在 4℃下 12000rpm 離心 15 分鐘，取上清液作為蛋白樣品。采用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行 SDS - PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂奶粉封閉膜 1 小時(shí)后，加入 M2 受體特異性一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用 TBST 緩沖液洗滌膜 3 次，每次 10 分鐘，然后加入熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育 1 小時(shí)。再次用 TBST 緩沖液洗滌后，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的信號(hào)強(qiáng)度，以評(píng)估 M2 受體的表達(dá)水平。

M2 受體功能檢測(cè) - 放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

采用放射性標(biāo)記的 M2 受體特異性配體（如 [3H] - 甲基東莨菪堿）進(jìn)行配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將經(jīng)梓醇處理和對(duì)照組的細(xì)胞用 PBS 洗滌后，加入含有不同濃度 [3H] - 甲基東莨菪堿的結(jié)合緩沖液（含有適量的 Mg2?和 Ca2?等離子），在一定溫度（如 25℃）下孵育一定時(shí)間（如 60 分鐘）。孵育結(jié)束后，通過(guò)快速過(guò)濾收集細(xì)胞，用冰冷的結(jié)合緩沖液洗滌多次，以去除未結(jié)合的配體。然后將濾膜放入閃爍液中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性強(qiáng)度。通過(guò) Scatchard 分析計(jì)算 M2 受體的親和力（Kd 值）和最大結(jié)合容量（Bmax 值），以評(píng)估 M2 受體的功能狀態(tài)。

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路檢測(cè) - ELISA 法

由于 M2 受體激活可影響細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，如抑制腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平降低。收集梓醇處理和對(duì)照組的細(xì)胞，按照 ELISA 試劑盒（用于檢測(cè) cAMP 水平）的說(shuō)明書操作，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) cAMP 的含量變化。同時(shí)，還可檢測(cè)其他相關(guān)信號(hào)分子（如 PKA、MAPK 等）的活性變化，以全面了解梓醇對(duì) M2 受體相關(guān)信號(hào)通路的影響。

三、結(jié)果

（一）轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞模型的鑒定

通過(guò) PCR 和基因測(cè)序驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 M2 受體基因的整合情況，結(jié)果表明成功構(gòu)建了含有人類 M2 受體基因的轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞株。在細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的 M2 受體特異性熒光信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)了 M2 受體在 CHO 細(xì)胞表面的表達(dá)。

（二）梓醇對(duì) M2 受體表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，不同濃度的地黃梓醇處理轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞不同時(shí)間后，M2 受體蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出濃度 - 時(shí)間依賴性變化。在較低濃度（1 - 10μM）和短時(shí)間（24 小時(shí)）處理時(shí)，M2 受體表達(dá)略有增加；而在高濃度（100μM）和長(zhǎng)時(shí)間（72 小時(shí)）處理后，M2 受體表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明梓醇對(duì) M2 受體表達(dá)具有雙向調(diào)節(jié)作用。

（三）梓醇對(duì) M2 受體功能的影響

放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梓醇處理后 M2 受體的親和力（Kd 值）和最大結(jié)合容量（Bmax 值）發(fā)生了改變。在一定濃度范圍內(nèi)（1 - 10μM），梓醇使 M2 受體的親和力增加，而在高濃度（100μM）時(shí)親和力有所降低；最大結(jié)合容量在低濃度梓醇處理下無(wú)明顯變化，但在高濃度處理下顯著減少。這提示梓醇對(duì) M2 受體的功能有復(fù)雜的調(diào)控作用，可能通過(guò)影響受體與配體的結(jié)合特性來(lái)實(shí)現(xiàn)。

（四）梓醇對(duì) M2 受體相關(guān)信號(hào)通路的影響

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，梓醇處理后細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平發(fā)生變化。在低濃度梓醇處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平略有降低，與 M2 受體激活后抑制 AC 活性的生理效應(yīng)相符；而在高濃度梓醇處理下，cAMP 水平出現(xiàn)異常變化，可能暗示高濃度梓醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生了其他復(fù)雜的影響。同時(shí)，對(duì)其他信號(hào)分子（如 PKA、MAPK 等）活性的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的變化，進(jìn)一步表明梓醇對(duì) M2 受體相關(guān)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)具有廣泛的調(diào)控作用。

四、討論

（一）地黃梓醇對(duì) M2 受體的作用機(jī)制

本研究結(jié)果表明地黃梓醇對(duì)轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞 M2 受體的表達(dá)和功能具有復(fù)雜的調(diào)控作用。在低濃度下，梓醇可能通過(guò)激活某些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn) M2 受體的表達(dá)和增強(qiáng)其與配體的親和力，從而模擬生理狀態(tài)下 M2 受體的激活過(guò)程。這種激活可能涉及到梓醇與細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的特定靶點(diǎn)相互作用，進(jìn)而影響受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯或穩(wěn)定性。然而，在高濃度下，梓醇可能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)或其他代償機(jī)制，導(dǎo)致 M2 受體表達(dá)下調(diào)和功能異常。這可能與梓醇對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子或其他相關(guān)蛋白的影響有關(guān)。

（二）與疾病相關(guān)性及潛在應(yīng)用價(jià)值

鑒于 M2 受體在多種疾病中的重要作用，地黃梓醇對(duì) M2 受體的調(diào)控作用具有潛在的臨床意義。在心律失常等與 M2 受體功能異常相關(guān)的疾病中，適當(dāng)濃度的梓醇可能通過(guò)調(diào)節(jié) M2 受體功能，恢復(fù)正常的心臟節(jié)律。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病，梓醇對(duì) M2 受體的影響可能與改善膽堿能神經(jīng)傳遞有關(guān)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，本研究結(jié)果也為開(kāi)發(fā)基于 M2 受體調(diào)控的新型藥物提供了新的思路，可進(jìn)一步探索梓醇類似物或其衍生物在治療相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

（三）研究的局限性與展望

盡管本研究在轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞模型上取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，CHO 細(xì)胞雖然是一種常用的細(xì)胞模型，但與體內(nèi)的原代細(xì)胞仍存在差異，可能無(wú)法完整模擬 M2 受體在體內(nèi)的真實(shí)生理環(huán)境。未來(lái)研究可考慮采用原代心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞等更接近生理狀態(tài)的細(xì)胞模型進(jìn)一步驗(yàn)證梓醇的作用。其次，本研究主要關(guān)注了梓醇對(duì) M2 受體本身及其直接相關(guān)信號(hào)通路的影響，對(duì)于梓醇在整個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和機(jī)體水平的作用機(jī)制尚需深入研究。例如，梓醇是否通過(guò)影響其他受體或細(xì)胞間通訊來(lái)間接調(diào)控 M2 受體功能等問(wèn)題需要進(jìn)一步探索。此外，在藥物研發(fā)方面，還需要進(jìn)一步優(yōu)化梓醇的結(jié)構(gòu)，提高其對(duì) M2 受體的選擇性和作用效果，同時(shí)評(píng)估其安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。

五、結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)基因 CHO 細(xì)胞模型深入探討了地黃梓醇對(duì) M2 受體的影響。結(jié)果表明梓醇對(duì) M2 受體的表達(dá)、功能和相關(guān)信號(hào)通路具有濃度 - 時(shí)間依賴性的復(fù)雜調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解地黃梓醇的藥理作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)基于 M2 受體調(diào)控的治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，未來(lái)仍需要更深入和全面的研究來(lái)完善對(duì)梓醇 - M2 受體相互作用的認(rèn)識(shí)，并將其更好地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。