基因治療作為一種新興的治療手段，在治療多種遺傳性和獲得性疾病方面展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，基因傳遞過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題之一是尋找安全、高效的載體系統(tǒng)。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性和潛在的致瘤性等問(wèn)題。因此，非病毒載體如納米材料受到了廣泛關(guān)注。
硅納米粒（SiNPs）由于其良好的穩(wěn)定性、易于表面修飾和可調(diào)節(jié)的物理化學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。多聚賴氨酸（PLL）是一種陽(yáng)離子聚合物，具有良好的生物相容性和與核酸的結(jié)合能力。將 PLL 修飾到 SiNPs 表面有望提高納米粒與核酸的相互作用，并促進(jìn)細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染。本研究旨在制備多聚賴氨酸硅納米粒，并深入研究其在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的性能。
正硅酸四乙酯（TEOS）、氨水、多聚賴氨酸（PLL，不同分子量）、3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基)-2,5 - 二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、熒光標(biāo)記的 DNA（F - DNA）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM、RPMI 1640 等）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、不同細(xì)胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）。
硅納米粒的合成
采用經(jīng)典的 St?ber 法合成硅納米粒。在乙醇 - 水混合溶液中，將正硅酸四乙酯（TEOS）在氨水的催化作用下發(fā)生水解和縮聚反應(yīng)。具體步驟如下：將一定量的乙醇、水和氨水混合均勻，然后逐滴加入 TEOS。反應(yīng)在室溫下持續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)后，通過(guò)離心收集納米粒，并用乙醇多次洗滌以去除雜質(zhì)，得到純凈的硅納米粒。
多聚賴氨酸修飾硅納米粒
將合成的硅納米粒分散在適當(dāng)?shù)木彌_溶液（如磷酸鹽緩沖液，PBS）中。然后，將不同濃度的多聚賴氨酸溶液逐滴加入到納米粒分散液中，在溫和攪拌下反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心洗滌去除未結(jié)合的多聚賴氨酸，得到多聚賴氨酸硅納米粒（PLL - SiNPs）。通過(guò)改變 PLL 的濃度和反應(yīng)時(shí)間等條件，優(yōu)化修飾過(guò)程，以獲得最佳性能的納米粒。
粒徑和電位測(cè)定
使用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）儀器測(cè)定納米粒的粒徑大小和表面電位。將制備好的 PLL - SiNPs 分散在 PBS 中，測(cè)量其粒徑分布和平均粒徑，同時(shí)測(cè)量納米粒表面的 zeta 電位，以評(píng)估納米粒的穩(wěn)定性和表面電荷性質(zhì)。
形態(tài)觀察
通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒的形態(tài)。將納米粒分散液滴在銅網(wǎng)上，晾干后在 TEM 下觀察其形狀、大小和分散情況。
細(xì)胞培養(yǎng)
將不同的細(xì)胞系（如 HeLa、293T、MCF - 7 等）培養(yǎng)在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的相應(yīng)培養(yǎng)基中，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
納米粒標(biāo)記與攝取檢測(cè)
將 PLL - SiNPs 與熒光標(biāo)記的 DNA（F - DNA）混合，孵育一段時(shí)間后，加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中。在不同時(shí)間點(diǎn)（如 1、2、4、6 小時(shí)等），用 PBS 洗滌細(xì)胞，然后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，以評(píng)估納米粒的細(xì)胞攝取情況。同時(shí)，利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
將含有報(bào)告基因（如綠色熒光蛋白基因，GFP）的質(zhì)粒 DNA 與 PLL - SiNPs 混合，形成納米粒 - DNA 復(fù)合物。將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間（24 - 48 小時(shí)）后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量分析轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
通過(guò)改變納米粒與 DNA 的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染溫度等條件，優(yōu)化轉(zhuǎn)染過(guò)程，以獲得最高的轉(zhuǎn)染效率。
MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力
將不同濃度的 PLL - SiNPs 加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng) 24、48 和 72 小時(shí)后，加入 MTT 溶液。繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，加入 DMSO 溶解結(jié)晶物。在酶標(biāo)儀上測(cè)定 570nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力，評(píng)估納米粒的細(xì)胞毒性。
粒徑和電位
動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示，合成的硅納米粒粒徑在一定范圍內(nèi)（例如 100 - 200nm），表面電位為負(fù)。經(jīng)過(guò)多聚賴氨酸修飾后，PLL - SiNPs 的粒徑略有增加，這可能是由于 PLL 的附著。同時(shí)，表面電位變?yōu)檎@有利于與帶負(fù)電的 DNA 相互作用。
形態(tài)觀察
透射電子顯微鏡圖像表明，硅納米粒呈球形，粒徑均勻，分散良好。多聚賴氨酸修飾后，納米粒的形態(tài)基本保持不變。
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞對(duì) PLL - SiNPs - F - DNA 復(fù)合物的攝取量逐漸增加。共聚焦激光掃描顯微鏡圖像清晰地顯示了納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，部分納米粒可進(jìn)入細(xì)胞核周圍區(qū)域。不同細(xì)胞系對(duì)納米粒的攝取效率有所差異，這可能與細(xì)胞類型相關(guān)的膜受體和內(nèi)吞機(jī)制有關(guān)。
轉(zhuǎn)染效率
熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)定量分析表明，PLL - SiNPs 在多種細(xì)胞系中均能實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。在優(yōu)化條件下，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到較高水平，例如在 HeLa 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到 [X]%，與一些傳統(tǒng)的非病毒載體相比具有一定優(yōu)勢(shì)。
轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
研究發(fā)現(xiàn)，納米粒與 DNA 的比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率有顯著影響。當(dāng)比例為 [最佳比例] 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率高。此外，轉(zhuǎn)染時(shí)間和溫度也對(duì)轉(zhuǎn)染效果有一定影響，適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間和在 37°C 下轉(zhuǎn)染有利于提高轉(zhuǎn)染效率。
MTT 法檢測(cè)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)（如低于 [具體濃度]），PLL - SiNPs 對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯影響，表明納米粒具有良好的生物相容性。然而，當(dāng)納米粒濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞活力會(huì)有所下降，提示在實(shí)際應(yīng)用中需要注意納米粒的使用劑量。
本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒，并對(duì)其細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)染效率和生物相容性進(jìn)行了詳細(xì)研究。多聚賴氨酸的修飾不僅改變了硅納米粒的表面電荷，有利于與 DNA 的結(jié)合，還促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLL - SiNPs 作為一種非病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，其性能可通過(guò)優(yōu)化納米粒與 DNA 的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間和溫度等條件進(jìn)一步提高。
生物相容性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，在合適的濃度范圍內(nèi)，納米粒對(duì)細(xì)胞活力影響較小，這為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有利條件。然而，仍需要進(jìn)一步深入研究納米粒在體內(nèi)的分布、代謝和長(zhǎng)期安全性等問(wèn)題。此外，與其他先進(jìn)的載體系統(tǒng)相比，PLL - SiNPs 的轉(zhuǎn)染效率還有進(jìn)一步提升的空間，可以考慮結(jié)合其他功能分子或采用新型的制備策略來(lái)改進(jìn)。
本研究制備的多聚賴氨酸硅納米粒具有良好的理化性質(zhì)、較高的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染效率以及可接受的生物相容性。這些結(jié)果為其在基因治療和其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持。未來(lái)的研究將聚焦于進(jìn)一步優(yōu)化納米粒的性能和深入評(píng)估其體內(nèi)安全性，以推動(dòng)其向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。
