煙草（Nicotiana tabacum）作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物和模式植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物科學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用?；蚬こ碳夹g(shù)為煙草的遺傳改良提供了強(qiáng)大的手段，其中花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有更好的優(yōu)勢(shì)，如能夠避免體細(xì)胞變異、可直接獲得轉(zhuǎn)基因配子等。脫外壁花粉由于去除了外壁的物理屏障，理論上更有利于外源基因的導(dǎo)入?；驑尫ㄗ鳛橐环N常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，已在多種植物材料的轉(zhuǎn)化中取得成功。然而，關(guān)于基因槍法介導(dǎo) GUS 基因轉(zhuǎn)入煙草脫外壁花粉的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，旨在深入了解這一轉(zhuǎn)化過(guò)程的特性和規(guī)律，為煙草遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的拓展提供有價(jià)值的信息。
選用煙草（Nicotiana tabacum L.）品種‘K326’作為實(shí)驗(yàn)材料。在溫室中培養(yǎng)煙草植株，保持適宜的溫度（25 ± 2°C）、濕度（60% - 70%）和光照周期（16 h 光照 / 8 h 黑暗）。
采集處于單核靠邊期的煙草花蕾，用 70% 乙醇表面消毒 30 s，再用 0.1% HgCl?消毒 8 - 10 min，然后用無(wú)菌水沖洗 3 - 4 次。
將消毒后的花蕾在無(wú)菌條件下取出花藥，置于含有 10% 蔗糖、0.01% 硼酸、0.5% 纖維素酶和 0.2% 果膠酶的酶解液中，在 28°C、黑暗條件下酶解 2 - 3 h。
酶解結(jié)束后，通過(guò) 40 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，收集花粉，用 15% 蔗糖溶液離心洗滌 2 - 3 次，得到脫外壁花粉，將其懸浮于適量的轉(zhuǎn)化緩沖液中備用。
質(zhì)粒構(gòu)建
構(gòu)建含有 GUS 基因的植物表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒以 CaMV 35S 為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) GUS 基因的表達(dá)，并含有篩選標(biāo)記基因（如潮霉素抗性基因）。
金粉準(zhǔn)備
稱取 60 mg 直徑為 1.0 μm 的金粉，懸浮于 1 mL 無(wú)水乙醇中，振蕩混勻后離心收集金粉，用無(wú)菌水洗滌 2 - 3 次，最后將金粉重新懸浮于 1 mL 無(wú)菌水中，備用。
微彈制備
取 50 μL 金粉懸浮液，依次加入 10 μL 質(zhì)粒 DNA（濃度為 1 μg/μL）、50 μL 2.5 M CaCl?和 20 μL 0.1 M 亞精胺，振蕩混勻后靜置 10 min，離心收集沉淀，用 70% 乙醇和無(wú)水乙醇各洗滌一次，最后將沉淀重新懸浮于 60 μL 無(wú)水乙醇中。
基因槍射擊
將適量的脫外壁花粉均勻涂布于培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基表面，待花粉稍干燥后，將制備好的微彈用基因槍（Bio - Rad PDS - 1000/He）按照設(shè)定的參數(shù)（如氦氣壓力 1100 psi、真空度 28 inHg、射擊距離 6 cm 等）進(jìn)行射擊。
組織化學(xué)染色
在基因槍轉(zhuǎn)化后 24 - 48 h，取部分轉(zhuǎn)化后的花粉，加入 GUS 染色液（含有 1 mM X - Gluc、50 mM 磷酸鈉緩沖液 pH 7.0、0.5 mM 、0.5 mM 、0.1% Triton X - 100），在 37°C 黑暗條件下染色 2 - 4 h。染色結(jié)束后，用 70% 乙醇脫色，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)藍(lán)色染色的花粉數(shù)量，以計(jì)算 GUS 基因的瞬時(shí)表達(dá)率。
熒光定量分析
提取轉(zhuǎn)化后花粉的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以煙草 Actin 基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì) GUS 基因和 Actin 基因的特異性引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)檢測(cè) GUS 基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系按照 SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，在熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95°C 預(yù)變性 3 min；95°C 變性 10 s，60°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析數(shù)據(jù)，計(jì)算 GUS 基因相對(duì)表達(dá)量。
為了提高基因槍介導(dǎo)的 GUS 基因轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)行了一系列轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，包括金粉用量、質(zhì)粒 DNA 濃度、氦氣壓力、真空度和射擊距離等因素。每個(gè)因素設(shè)置 3 - 5 個(gè)水平，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以 GUS 基因瞬時(shí)表達(dá)率為指標(biāo)，篩選出最佳的轉(zhuǎn)化條件組合。
經(jīng)過(guò)酶解處理后獲得的煙草脫外壁花粉在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)出球形，表面光滑，與完整外壁花粉具有明顯的形態(tài)差異。脫外壁花粉的直徑略有減小，且細(xì)胞質(zhì)更加明顯，這表明外壁已被有效去除，為外源基因的導(dǎo)入提供了有利條件。
組織化學(xué)染色結(jié)果
通過(guò) GUS 組織化學(xué)染色，在基因槍轉(zhuǎn)化后的花粉中觀察到部分花粉呈現(xiàn)藍(lán)色，表明 GUS 基因在這些花粉中得到了表達(dá)。未轉(zhuǎn)化的對(duì)照花粉則無(wú)藍(lán)色出現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)不同處理組中藍(lán)色花粉的數(shù)量，計(jì)算得到 GUS 基因的瞬時(shí)表達(dá)率在不同條件下有所差異，范圍為 5% - 25%。
熒光定量分析結(jié)果
熒光定量 PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后的花粉中 GUS 基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)化的對(duì)照花粉。不同轉(zhuǎn)化條件下 GUS 基因的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與組織化學(xué)染色得到的瞬時(shí)表達(dá)率基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了 GUS 基因在煙草脫外壁花粉中的成功導(dǎo)入和表達(dá)。
經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，得到最佳的基因槍轉(zhuǎn)化條件組合為：金粉用量 30 μL、質(zhì)粒 DNA 濃度 0.8 μg/μL、氦氣壓力 1300 psi、真空度 26 inHg、射擊距離 5 cm。在該條件下，GUS 基因的瞬時(shí)表達(dá)率可達(dá)到 30% 以上，較優(yōu)化前有顯著提高。分析各因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響發(fā)現(xiàn)，氦氣壓力和金粉用量對(duì) GUS 基因瞬時(shí)表達(dá)率的影響較為顯著，而質(zhì)粒 DNA 濃度、真空度和射擊距離的影響相對(duì)較小。
煙草脫外壁花粉去除了外壁的阻礙，使得外源基因更容易進(jìn)入花粉細(xì)胞內(nèi)部。與完整外壁花粉相比，其在基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中可能具有更高的轉(zhuǎn)化效率。此外，脫外壁花粉的制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，且能夠保持花粉的活力和受精能力，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因操作提供了便利。
基因槍法作為一種物理轉(zhuǎn)化方法，具有操作簡(jiǎn)便、不受宿主限制等優(yōu)點(diǎn)。在本研究中，通過(guò)優(yōu)化基因槍轉(zhuǎn)化的各項(xiàng)參數(shù)，成功地將 GUS 基因?qū)霟煵菝撏獗诨ǚ鄄?shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá)。然而，基因槍法也存在一些不足之處，如設(shè)備昂貴、轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低等。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況綜合考慮其他轉(zhuǎn)化方法，以提高煙草花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
GUS 基因是一種常用的報(bào)告基因，在本研究中用于檢測(cè)外源基因在煙草脫外壁花粉中的表達(dá)情況。通過(guò)組織化學(xué)染色和熒光定量分析兩種方法，能夠直觀、準(zhǔn)確地反映 GUS 基因的瞬時(shí)表達(dá)水平。這為后續(xù)研究其他功能基因在煙草花粉中的表達(dá)調(diào)控提供了可靠的檢測(cè)手段。
本研究建立的基因槍法介導(dǎo) GUS 基因轉(zhuǎn)入煙草脫外壁花粉的轉(zhuǎn)化體系，為煙草的遺傳改良提供了新的技術(shù)途徑。通過(guò)將有益的外源基因?qū)霟煵莼ǚ?，可以獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，有望在煙草的抗病性、品質(zhì)改良等方面取得突破。此外，該技術(shù)也可為其他植物花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考和借鑒，促進(jìn)植物基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
本研究成功地建立了基因槍法介導(dǎo) GUS 基因轉(zhuǎn)入煙草脫外壁花粉的瞬時(shí)表達(dá)體系。通過(guò)對(duì)脫外壁花粉的制備、基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程的優(yōu)化以及 GUS 基因瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)與分析，確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件組合，提高了 GUS 基因的瞬時(shí)表達(dá)效率。本研究結(jié)果為煙草花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持，有助于推動(dòng)煙草基因工程育種的發(fā)展，同時(shí)也為其他植物相關(guān)研究提供了有益的參考。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探索該轉(zhuǎn)化體系在煙草功能基因組學(xué)研究和遺傳改良實(shí)踐中的應(yīng)用，以及如何進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性，以實(shí)現(xiàn)煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
