一、引言

1. 柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）作為雞球蟲病的主要病原之一，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。深入理解其生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及開展有效的防控策略研究，在禽病學(xué)領(lǐng)域具有極為關(guān)鍵的意義。而基因轉(zhuǎn)染技術(shù)作為研究基因功能的重要工具，在柔嫩艾美耳球蟲的研究中也占據(jù)著核心地位。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)以其操作相對簡便、轉(zhuǎn)染效率較高等優(yōu)勢，在眾多細(xì)胞與微生物的基因轉(zhuǎn)染研究中得到了廣泛應(yīng)用。然而，對于柔嫩艾美耳球蟲而言，由于其更好的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和生理特性，常規(guī)的電穿孔轉(zhuǎn)染條件往往難以達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效果。因此，開展針對柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化研究，是當(dāng)前該領(lǐng)域亟待解決的重要科學(xué)問題。這不僅有助于推動柔嫩艾美耳球蟲基礎(chǔ)生物學(xué)研究的深入發(fā)展，還將為新型抗球蟲藥物和疫苗的研發(fā)提供強(qiáng)有力的技術(shù)平臺。

二、材料與方法

1. 蟲株與細(xì)胞培養(yǎng)

• 柔嫩艾美耳球蟲蟲株：選用實(shí)驗(yàn)室保存的特定株系，該株系具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性和遺傳背景，已在前期研究中進(jìn)行了充分的鑒定和表征。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，通過雞體傳代擴(kuò)增，確保獲得足夠數(shù)量且活力良好的球蟲孢子化卵囊。

• 宿主細(xì)胞：采用適宜的雞胚腎細(xì)胞（CEK）進(jìn)行培養(yǎng)。將 CEK 細(xì)胞接種于特定的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用含適量血清、抗生素和營養(yǎng)成分的細(xì)胞培養(yǎng)液，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)的電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

• 電穿孔儀參數(shù)設(shè)置：選取電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)作為主要的電穿孔參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究。設(shè)置不同的電壓梯度，如 500V、600V、700V 等；脈沖時間設(shè)置為 10ms、20ms、30ms 等不同水平；脈沖次數(shù)則包括 1 次、2 次、3 次等多種組合。

• 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建含有特定報告基因（如綠色熒光蛋白基因，GFP）的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)過嚴(yán)格的設(shè)計(jì)和構(gòu)建流程，確保報告基因能夠在柔嫩艾美耳球蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且易于檢測。在構(gòu)建過程中，對質(zhì)粒的啟動子、終止子等關(guān)鍵元件進(jìn)行優(yōu)化選擇，以提高基因表達(dá)效率。

• 電穿孔轉(zhuǎn)染操作：將處于合適發(fā)育階段（如子孢子期）的柔嫩艾美耳球蟲與適量的重組質(zhì)?；旌希尤氲诫姶┛拙彌_液中，充分混勻后轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中。按照設(shè)定的電穿孔儀參數(shù)進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔后，將處理后的球蟲迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液中，在適宜條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，以觀察轉(zhuǎn)染效果。

3. 轉(zhuǎn)染效率檢測

• 熒光顯微鏡觀察：在轉(zhuǎn)染后的不同時間點(diǎn)（如 24 小時、48 小時、72 小時等），利用熒光顯微鏡觀察球蟲體內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。通過計(jì)數(shù)表達(dá)熒光的球蟲數(shù)量與總球蟲數(shù)量的比例，初步評估轉(zhuǎn)染效率。同時，觀察熒光強(qiáng)度和分布情況，以判斷基因表達(dá)的穩(wěn)定性和均勻性。

• 定量 PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)染后的球蟲總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，利用特異性引物對報告基因進(jìn)行定量 PCR 檢測。通過比較實(shí)驗(yàn)組與對照組中報告基因的相對表達(dá)量，進(jìn)一步精確測定轉(zhuǎn)染效率。在定量 PCR 實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置內(nèi)參基因，以校正實(shí)驗(yàn)誤差，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

三、結(jié)果

1. 電壓對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 當(dāng)脈沖時間和脈沖次數(shù)固定時，隨著電壓的逐漸升高，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在較低電壓（如 500V）下，轉(zhuǎn)染效率相對較低，僅有少量球蟲表達(dá)報告基因。隨著電壓升高到 600V 左右時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到峰值，大量球蟲呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，且熒光強(qiáng)度較高。然而，當(dāng)電壓進(jìn)一步升高至 700V 及以上時，轉(zhuǎn)染效率開始下降，同時觀察到球蟲的死亡率明顯增加，細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)異常變化。這可能是由于過高的電壓導(dǎo)致球蟲細(xì)胞膜受到過度損傷，影響了其正常的生理功能和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

2. 脈沖時間對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 在電壓和脈沖次數(shù)保持不變的情況下，不同脈沖時間對轉(zhuǎn)染效率也有著顯著的影響。較短的脈沖時間（如 10ms）下，轉(zhuǎn)染效率較低，可能是由于脈沖作用時間過短，不足以使質(zhì)粒充分進(jìn)入球蟲細(xì)胞內(nèi)。隨著脈沖時間延長至 20ms，轉(zhuǎn)染效率明顯提高，球蟲體內(nèi)的熒光信號增強(qiáng)。但當(dāng)脈沖時間過長（如 30ms）時，轉(zhuǎn)染效率并未進(jìn)一步提高，反而略有下降，且球蟲的活力受到一定程度的抑制。這表明過長的脈沖時間可能會對球蟲細(xì)胞產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，如引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏或細(xì)胞膜的不可逆損傷。

3. 脈沖次數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 當(dāng)電壓和脈沖時間確定后，改變脈沖次數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，單次脈沖時轉(zhuǎn)染效率相對較低，隨著脈沖次數(shù)增加到 2 次，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，更多的球蟲成功表達(dá)報告基因。但當(dāng)脈沖次數(shù)增加到 3 次及以上時，轉(zhuǎn)染效率的提升并不明顯，且球蟲的死亡率逐漸上升。這可能是因?yàn)檫^多的脈沖次數(shù)會對球蟲細(xì)胞造成累積性損傷，盡管在一定程度上增加了質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)會，但同時也破壞了細(xì)胞的生存環(huán)境和基因表達(dá)體系。

4. 多因素交互作用對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，研究發(fā)現(xiàn)電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)之間存在著復(fù)雜的交互作用。例如，在中等電壓（如 600V）和適中脈沖時間（如 20ms）的條件下，適當(dāng)增加脈沖次數(shù)（如 2 次）能夠獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率。而當(dāng)電壓較高或脈沖時間過長時，增加脈沖次數(shù)反而會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降和球蟲死亡率增加。這種交互作用表明，在優(yōu)化柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉(zhuǎn)染條件時，不能僅僅考慮單一因素的影響，而需要綜合考慮多個因素的協(xié)同作用，以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效果。

四、討論

1. 本研究通過系統(tǒng)地優(yōu)化柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉(zhuǎn)染條件，明確了電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響規(guī)律。研究結(jié)果表明，這些參數(shù)之間并非獨(dú)立作用，而是存在著復(fù)雜的交互關(guān)系。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求和球蟲的生理狀態(tài)，精確調(diào)整這些參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染。

2. 與以往的研究相比，本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測手段上具有一定的創(chuàng)新性。例如，采用了多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，全面地分析了各參數(shù)之間的交互作用，避免了傳統(tǒng)單因素實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致的片面性結(jié)論。同時，結(jié)合熒光顯微鏡觀察和定量 PCR 檢測兩種技術(shù)手段，從不同層面準(zhǔn)確地評估了轉(zhuǎn)染效率，提高了結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

3. 然而，本研究也存在一些不足之處。例如，在實(shí)驗(yàn)過程中僅考慮了電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)等電穿孔儀的主要參數(shù)，而對于電穿孔緩沖液的成分、球蟲的預(yù)處理方式等其他可能影響轉(zhuǎn)染效率的因素未進(jìn)行深入研究。此外，本研究僅在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對于體內(nèi)環(huán)境下的轉(zhuǎn)染效果及其影響因素還需要進(jìn)一步探索。在未來的研究中，將進(jìn)一步拓展研究范圍，綜合考慮更多的因素，完善柔嫩艾美耳球蟲電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)體系，為球蟲病的深入研究和防控提供更有力的技術(shù)支持。