一、引言

1. 蓖麻的重要性

• 蓖麻（Ricinus communis L.）是一種重要的非食用油料作物，其種子含油量豐富，且蓖麻油具有更好的理化性質(zhì)，在工業(yè)、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。例如，在潤滑油、涂料、塑料添加劑以及生物柴油等方面都有著不可替代的作用。隨著全球工業(yè)的發(fā)展和對可再生資源需求的增加，蓖麻的種植和利用受到越來越多的關(guān)注。

2. 雜草危害與傳統(tǒng)除草方式的局限

• 在蓖麻種植過程中，雜草危害是影響產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。雜草與蓖麻競爭養(yǎng)分、水分、光照和空間等資源，導(dǎo)致蓖麻生長發(fā)育受阻，產(chǎn)量降低。傳統(tǒng)的除草方式主要包括人工除草和化學(xué)除草。人工除草勞動(dòng)強(qiáng)度大、效率低，成本較高，難以滿足大規(guī)模種植的需求?；瘜W(xué)除草雖然相對高效，但常用除草劑往往對蓖麻存在一定的藥害風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在蓖麻田中的應(yīng)用。

3. 抗草甘膦基因轉(zhuǎn)化的意義

• 草甘膦是一種廣譜、高效、低毒的除草劑，其作用機(jī)制是抑制植物體內(nèi) 5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的合成，導(dǎo)致植物死亡。通過將抗草甘膦基因?qū)氡吐椋嘤共莞熟⑥D(zhuǎn)基因蓖麻品種，能夠有效解決雜草問題，實(shí)現(xiàn)田間草害的精準(zhǔn)防控，減少除草成本，提高蓖麻種植的經(jīng)濟(jì)效益和生產(chǎn)效率，同時(shí)也有助于推動(dòng)蓖麻的規(guī)模化、現(xiàn)代化種植。

二、材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• （1）植物材料：選用適宜當(dāng)?shù)胤N植且具有一定優(yōu)良性狀的蓖麻品種作為實(shí)驗(yàn)材料，選取飽滿、無病蟲害的種子用于萌動(dòng)種胚轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

• （2）菌株與載體：采用含有抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌菌株，該菌株經(jīng)過鑒定具有良好的侵染活性和遺傳穩(wěn)定性。載體為經(jīng)過改造的雙元載體，其 T - DNA 區(qū)域包含抗草甘膦基因表達(dá)盒，以及用于篩選轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因等。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

• （1）蓖麻種子預(yù)處理：將蓖麻種子用濃硫酸處理一定時(shí)間，以破除種皮的休眠和機(jī)械障礙，然后用無菌水反復(fù)沖洗至中性。接著將種子在無菌條件下浸泡于含有適量抗生素的萌發(fā)培養(yǎng)基中，在特定的溫度、光照和濕度條件下進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。

• （2）農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與侵染液制備：將含有抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌菌株接種于含有相應(yīng)抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。然后收集菌體，用侵染緩沖液（如 MS 液體培養(yǎng)基添加一定濃度的乙酰丁香酮等物質(zhì)）重懸，調(diào)整菌液濃度至合適范圍，制備成侵染液。

• （3）萌動(dòng)種胚的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化：當(dāng)蓖麻種子萌發(fā)至種胚剛剛萌動(dòng)，露出少量胚根時(shí)，將種胚浸入制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，在真空條件下處理一定時(shí)間，以促進(jìn)農(nóng)桿菌進(jìn)入種胚組織。侵染結(jié)束后，用無菌濾紙吸干種胚表面多余菌液，然后將種胚轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在黑暗條件下共培養(yǎng)一定天數(shù)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基添加了適量的生長素和細(xì)胞分裂素等植物激素，以維持種胚的生長狀態(tài)并促進(jìn)農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞的相互作用。

• （4）篩選與再生培養(yǎng)：共培養(yǎng)結(jié)束后，將種胚轉(zhuǎn)移至含有篩選劑（如草甘膦和抗生素）的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。在篩選過程中，未轉(zhuǎn)化的種胚由于無法耐受篩選劑的作用而死亡，而轉(zhuǎn)化成功的種胚則能夠繼續(xù)生長發(fā)育。經(jīng)過多輪篩選后，將存活的抗性愈傷組織或胚狀體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上，在適宜的光照和溫度條件下進(jìn)行再生培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化形成芽和根，最終獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株。

• （5）分子鑒定：采用 PCR 技術(shù)對再生植株進(jìn)行分子鑒定。提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組 DNA，以其為模板，利用特異性引物對抗草甘膦基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)與目的基因大小相符的條帶，則初步表明抗草甘膦基因已整合到蓖麻基因組中。進(jìn)一步采用 Southern blot 雜交技術(shù)對陽性植株進(jìn)行驗(yàn)證，確定抗草甘膦基因在蓖麻基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)，以確?；蛘系姆€(wěn)定性和可靠性。同時(shí)，采用 RT - PCR 技術(shù)檢測抗草甘膦基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，分析其表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)空特異性。

三、結(jié)果與分析

1. 蓖麻種子萌發(fā)情況

• 經(jīng)過濃硫酸處理和萌發(fā)培養(yǎng)后，蓖麻種子的萌發(fā)率達(dá)到了一定水平。不同處理時(shí)間和萌發(fā)條件對種子萌發(fā)有顯著影響。在適宜的處理?xiàng)l件下，種子在較短時(shí)間內(nèi)開始萌發(fā)，且萌發(fā)整齊度較高。例如，濃硫酸處理 [X] 分鐘后，在溫度為 [XX]℃、光照強(qiáng)度為 [XXX] lx、光照時(shí)間為 [XX] 小時(shí) / 天的條件下，種子萌發(fā)率可達(dá) [XX]% 以上，且種胚萌動(dòng)狀態(tài)較為一致，為后續(xù)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化提供了良好的基礎(chǔ)材料。

2. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化效率

• 通過對不同侵染時(shí)間、菌液濃度和共培養(yǎng)條件等因素的優(yōu)化，確定了最佳的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系。在最佳轉(zhuǎn)化條件下，轉(zhuǎn)化后的蓖麻萌動(dòng)種胚經(jīng)過篩選培養(yǎng)，獲得了一定數(shù)量的抗性愈傷組織和再生植株。例如，當(dāng)侵染時(shí)間為 [XX] 分鐘、菌液濃度為 [ODXX]、共培養(yǎng)時(shí)間為 [XX] 天、共培養(yǎng)溫度為 [XX]℃時(shí)，轉(zhuǎn)化效率高，可達(dá) [XX]%。對獲得的再生植株進(jìn)行分子鑒定，PCR 檢測結(jié)果顯示，陽性植株比例為 [XX]%，表明抗草甘膦基因已成功整合到部分蓖麻植株的基因組中。Southern blot 雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了基因整合的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，且大部分轉(zhuǎn)基因植株中抗草甘膦基因的整合拷貝數(shù)在合理范圍內(nèi)。RT - PCR 檢測結(jié)果表明，抗草甘膦基因在轉(zhuǎn)基因植株的不同組織和發(fā)育階段均有表達(dá)，且表達(dá)水平存在一定差異，在葉片等光合組織中的表達(dá)相對較高，這與草甘膦主要作用于地上部分的作用特點(diǎn)相適應(yīng)。

3. 轉(zhuǎn)基因植株的表型與草甘膦抗性鑒定

• 對轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓赀M(jìn)行田間表型觀察，在未噴施草甘膦時(shí)，兩者在植株形態(tài)、生長速率等方面無明顯差異。當(dāng)對生長至一定階段的植株噴施一定濃度的草甘膦后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暝诙虝r(shí)間內(nèi)出現(xiàn)葉片黃化、枯萎，生長停滯甚至死亡等典型的草甘膦藥害癥狀，而轉(zhuǎn)基因植株則能夠正常生長發(fā)育，僅在高濃度草甘膦處理時(shí)，部分葉片出現(xiàn)輕微黃化，但仍能恢復(fù)生長并完成生育周期。通過對轉(zhuǎn)基因植株在不同草甘膦濃度處理下的存活率、株高、生物量等指標(biāo)的測定，進(jìn)一步量化了其草甘膦抗性水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對草甘膦具有顯著的抗性，能夠耐受田間常規(guī)除草劑量的草甘膦噴施，且在一定程度上對高濃度草甘膦也具有較好的耐受性，這為其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了有力保障。

四、討論

1. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)萌動(dòng)種胚轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢

• 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是植物基因工程中常用的一種方法，其具有轉(zhuǎn)化效率較高、可導(dǎo)入大片段 DNA、整合位點(diǎn)相對穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的基于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)萌動(dòng)種胚轉(zhuǎn)化具有更好的優(yōu)勢。萌動(dòng)種胚具有較強(qiáng)的再生能力和細(xì)胞分裂活性，能夠更好地接受農(nóng)桿菌的侵染并整合外源基因。同時(shí)，該方法省略了復(fù)雜的愈傷組織誘導(dǎo)和長期的組織培養(yǎng)過程，減少了體細(xì)胞變異的發(fā)生，縮短了轉(zhuǎn)基因植株的獲得周期，有利于保持蓖麻的優(yōu)良性狀。此外，萌動(dòng)種胚轉(zhuǎn)化操作相對簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和高超的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，便于在一般實(shí)驗(yàn)室條件下開展，為蓖麻基因工程育種的推廣應(yīng)用提供了可能。

2. 影響轉(zhuǎn)化效率的因素

• （1）種子預(yù)處理：濃硫酸處理時(shí)間和萌發(fā)條件對種子萌發(fā)和后續(xù)轉(zhuǎn)化效率有著關(guān)鍵影響。處理時(shí)間過長可能會損傷種胚細(xì)胞，降低其活力和轉(zhuǎn)化能力；處理時(shí)間過短則可能無法有效破除種皮障礙，影響農(nóng)桿菌的侵染。萌發(fā)條件如溫度、光照和濕度等也需要精確控制，以確保種胚在最佳狀態(tài)下接受轉(zhuǎn)化。

• （2）農(nóng)桿菌侵染參數(shù)：侵染時(shí)間、菌液濃度和共培養(yǎng)條件是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。侵染時(shí)間過短，農(nóng)桿菌無法充分與種胚細(xì)胞接觸并完成基因轉(zhuǎn)移；侵染時(shí)間過長則可能導(dǎo)致種胚細(xì)胞過度損傷。菌液濃度過高可能會對種胚產(chǎn)生毒害作用，影響其生長和轉(zhuǎn)化；菌液濃度過低則會降低轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分、溫度、光照和共培養(yǎng)時(shí)間等也需要優(yōu)化，以促進(jìn)農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞的相互作用和基因整合。

• （3）篩選與再生培養(yǎng)：篩選劑的種類和濃度選擇不當(dāng)可能會導(dǎo)致假陽性或真陽性植株的丟失。再生培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件需要根據(jù)蓖麻的生長特性進(jìn)行優(yōu)化，以提高再生植株的質(zhì)量和轉(zhuǎn)化效率。

3. 轉(zhuǎn)基因蓖麻的應(yīng)用前景與安全性考慮

• （1）應(yīng)用前景：抗草甘膦轉(zhuǎn)基因蓖麻的成功培育為蓖麻種植中的雜草管理提供了有效手段，能夠顯著提高蓖麻的產(chǎn)量和品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，增強(qiáng)蓖麻在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的競爭力。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因蓖麻也為蓖麻的遺傳改良提供了新的途徑，可以進(jìn)一步導(dǎo)入其他有益基因，如抗蟲、抗病、耐逆等基因，培育出綜合性狀優(yōu)良的蓖麻新品種，滿足不同領(lǐng)域?qū)Ρ吐楫a(chǎn)品的需求，推動(dòng)蓖麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

• （2）安全性考慮：隨著轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用，其安全性問題一直備受關(guān)注。對于轉(zhuǎn)基因蓖麻，需要重點(diǎn)考慮其對生態(tài)環(huán)境和人類健康的潛在影響。在生態(tài)環(huán)境方面，需要評估轉(zhuǎn)基因蓖麻是否會通過花粉傳播等途徑將抗草甘膦基因轉(zhuǎn)移到野生近緣種或其他非目標(biāo)植物中，從而導(dǎo)致雜草抗藥性的產(chǎn)生或?qū)ι鷳B(tài)平衡造成破壞。在人類健康方面，需要研究轉(zhuǎn)基因蓖麻種子及其加工產(chǎn)品中的抗草甘膦蛋白等成分是否會對人體產(chǎn)生過敏、毒性等不良影響。因此，在轉(zhuǎn)基因蓖麻的推廣應(yīng)用過程中，需要建立完善的監(jiān)測和評估體系，加強(qiáng)安全監(jiān)管，確保其安全、可持續(xù)地應(yīng)用。