一、引言

二、材料與方法

1. 黑曲霉菌株與培養(yǎng)條件

• 本實(shí)驗(yàn)所采用的黑曲霉菌株來源于特定的菌種保藏中心，具有典型的黑曲霉生物學(xué)特征。將黑曲霉菌株接種于含有特定營養(yǎng)成分（如葡萄糖、硫酸鎂等）的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度（如 30°C）、濕度和通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)。通過定期觀察菌落形態(tài)、菌絲生長狀況等指標(biāo)，確保菌株處于良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的模板材料。

2. pyrG 基因克隆

• 引物設(shè)計(jì)：基于黑曲霉已知的基因組序列信息，利用專業(yè)的生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)針對 pyrG 基因的特異性引物。引物的設(shè)計(jì)遵循引物長度適宜（一般 18 - 25bp）、GC 含量適中（40% - 60%）、避免二級結(jié)構(gòu)形成以及在基因序列上具有特異性結(jié)合位點(diǎn)等原則。設(shè)計(jì)完成后，對引物進(jìn)行合成并通過高效液相色譜法進(jìn)行純化，以保證引物的純度和質(zhì)量。

• 基因組 DNA 提取：采用改良的 CTAB 法提取黑曲霉基因組 DNA。首先，收集適量的黑曲霉菌絲體，在液氮中研磨成細(xì)粉，迅速轉(zhuǎn)移至含有 CTAB 裂解緩沖液的離心管中。接著，在 65°C 水浴中孵育一段時(shí)間，期間適時(shí)輕柔混勻。然后，加入等體積的氯仿 / 異戊醇混合液，充分振蕩混勻后離心，取上清液。重復(fù)氯仿 / 異戊醇抽提步驟以進(jìn)一步純化 DNA。最后，加入異丙醇沉淀 DNA，用 70% 乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于適量的 TE 緩沖液中。通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 的完整性和濃度。

• PCR 擴(kuò)增：以提取的黑曲霉基因組 DNA 為模板，加入設(shè)計(jì)好的特異性引物、高保真 DNA 聚合酶、dNTPs 以及相應(yīng)的 PCR 緩沖液，在 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，包括預(yù)變性溫度（如 95°C，5min）、變性溫度（95°C，30s）、退火溫度（根據(jù)引物 Tm 值確定，一般 55 - 60°C，30s）、延伸溫度（72°C，根據(jù)目的基因長度確定延伸時(shí)間，一般 1 - 2min/kb）以及循環(huán)次數(shù)（一般 30 - 35 個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增結(jié)束后，取部分 PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)。

3. 同源轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建

• 選擇合適的質(zhì)粒載體（如具有多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因等功能元件的載體），利用限制性內(nèi)切酶對載體和擴(kuò)增得到的 pyrG 基因片段進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系中包含適量的限制性內(nèi)切酶、緩沖液和 DNA 片段，在適宜的溫度下孵育足夠的時(shí)間。酶切完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的載體片段。然后，在 T4 DNA 連接酶的作用下，將 pyrG 基因片段與線性化載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)在適宜的溫度（如 16°C）下過夜進(jìn)行，構(gòu)建成同源轉(zhuǎn)化載體。

4. 黑曲霉原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

• 原生質(zhì)體制備：收集處于對數(shù)生長期的黑曲霉菌絲體，用適當(dāng)濃度的滲透壓穩(wěn)定劑（如 1.2M 山梨醇溶液）洗滌菌絲體。然后，加入含有特定細(xì)胞壁水解酶（如蝸牛酶、纖維素酶等混合酶液）的消化液，在適宜的溫度（如 30°C）和振蕩條件下進(jìn)行細(xì)胞壁消化反應(yīng)。每隔一段時(shí)間取樣，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放情況。當(dāng)原生質(zhì)體釋放量達(dá)到一定比例時(shí)，通過過濾除去未消化的菌絲體殘?jiān)?，再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌原生質(zhì)體，最后將原生質(zhì)體懸浮于適量的 STC 緩沖液中，調(diào)整原生質(zhì)體濃度至合適范圍（如 1×10? - 1×10?/ml）。

• 轉(zhuǎn)化反應(yīng)：將構(gòu)建好的同源轉(zhuǎn)化載體與適量的黑曲霉原生質(zhì)體混合均勻，加入 PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化溶液，在冰上孵育一段時(shí)間（如 20 - 30min），然后迅速轉(zhuǎn)移至 42°C 水浴中熱激一定時(shí)間（如 5min）。熱激結(jié)束后，迅速冷卻至冰浴，加入適量的預(yù)冷的 STC 緩沖液和再生培養(yǎng)基，混勻后涂布于含有特定篩選劑（根據(jù)載體上的篩選標(biāo)記基因確定，如潮霉素 B）的再生平板上。在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察轉(zhuǎn)化子的生長情況并進(jìn)行篩選鑒定。

三、結(jié)果與分析

1. pyrG 基因克隆結(jié)果

• 通過 PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期大小位置出現(xiàn)清晰的條帶，表明成功擴(kuò)增出 pyrG 基因片段。對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示與已知的黑曲霉 pyrG 基因序列具有高度的同源性，進(jìn)一步驗(yàn)證了克隆的準(zhǔn)確性。測序結(jié)果還可以用于分析基因序列中的一些特殊結(jié)構(gòu)和變異情況，為后續(xù)研究其功能奠定基礎(chǔ)。

2. 同源轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建驗(yàn)證

• 對構(gòu)建的同源轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行酶切鑒定，得到與預(yù)期大小相符的片段，說明載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行再次酶切驗(yàn)證和測序分析，確保載體在大腸桿菌中能夠穩(wěn)定存在且序列正確，為后續(xù)黑曲霉的轉(zhuǎn)化提供可靠的載體來源。

3. 原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化效果

• 在原生質(zhì)體制備過程中，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著消化時(shí)間的延長，原生質(zhì)體逐漸從菌絲體中釋放出來，在最佳消化時(shí)間時(shí)，原生質(zhì)體釋放率可達(dá)到 80% - 90%。經(jīng)過轉(zhuǎn)化操作后，在含有篩選劑的再生平板上出現(xiàn)了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化子菌落。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示大部分轉(zhuǎn)化子中成功整合了 pyrG 基因片段，表明同源轉(zhuǎn)化取得了較好的效果。通過對轉(zhuǎn)化子的生長特性、代謝產(chǎn)物合成等方面的初步分析，發(fā)現(xiàn)與野生型黑曲霉相比，部分轉(zhuǎn)化子在某些性狀上出現(xiàn)了明顯的變化，進(jìn)一步證明了 pyrG 基因同源轉(zhuǎn)化對黑曲霉的遺傳改造產(chǎn)生了影響。

四、結(jié)論與展望