細(xì)胞來(lái)源：手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織，取自患者（經(jīng)患者知情同意）。

主要試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素 - 鏈霉素雙抗、電穿孔緩沖液、無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒 DNA（含有目的基因，如綠色熒光蛋白 GFP 基因，用于觀察轉(zhuǎn)染效果）、臺(tái)盼藍(lán)染液。

實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡、電穿孔儀、細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器等。

組織處理：將手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織置于含雙抗的 PBS 中，沖洗去除血液和雜質(zhì)。將組織剪成約 1mm3 大小的組織塊，用 0.25% 胰蛋白酶在 37℃消化 30 - 45 分鐘。

細(xì)胞接種：消化結(jié)束后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打組織塊，使細(xì)胞分散。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄上清。用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：待細(xì)胞融合至 80% - 90% 時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按 1:2 或 1:3 的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中。取第 3 - 5 代細(xì)胞用于電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞準(zhǔn)備：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷的電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10? - 5×10?個(gè) /ml。

DNA 準(zhǔn)備：將無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒 DNA 用無(wú)菌水稀釋至合適濃度，如 1 - 5μg/μl。

電穿孔操作：取 100μl 細(xì)胞懸液與適量的質(zhì)粒 DNA 混合，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至電穿孔杯中。將電穿孔杯放入電穿孔儀中，設(shè)置不同的電場(chǎng)強(qiáng)度（如 100V/cm、200V/cm、300V/cm）、脈沖時(shí)間（如 10ms、20ms、30ms）和脈沖次數(shù)（如 1 次、2 次、3 次）進(jìn)行電穿孔處理。電穿孔結(jié)束后，迅速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含預(yù)熱培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，輕輕搖勻。

細(xì)胞培養(yǎng)與觀察：將培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)、48 小時(shí)和 72 小時(shí)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，用臺(tái)盼藍(lán)染液染色，計(jì)算細(xì)胞活力。

在不同電場(chǎng)強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)明顯差異。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為 100V/cm 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率較低，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少；隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加到 200V/cm，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多；但當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)一步升高到 300V/cm 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率并未持續(xù)上升，反而出現(xiàn)部分細(xì)胞死亡，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少。

脈沖時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有影響。在較短的脈沖時(shí)間（如 10ms）下，轉(zhuǎn)染效率較低；當(dāng)脈沖時(shí)間延長(zhǎng)至 20ms 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率有所提高；然而，當(dāng)脈沖時(shí)間達(dá)到 30ms 時(shí)，細(xì)胞毒性明顯增加，轉(zhuǎn)染效率也未明顯改善。

脈沖次數(shù)方面，1 次脈沖時(shí)轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，2 次脈沖時(shí)轉(zhuǎn)染效率有所提高，但 3 次脈沖時(shí)細(xì)胞死亡率顯著增加，轉(zhuǎn)染效率并未顯著提升。綜合來(lái)看，在電場(chǎng)強(qiáng)度為 200V/cm、脈沖時(shí)間為 20ms、脈沖次數(shù)為 2 次的條件下，原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá) 30% - 40%。

通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加、脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)和脈沖次數(shù)的增多，細(xì)胞死亡率逐漸升高。在高電場(chǎng)強(qiáng)度（300V/cm）、長(zhǎng)脈沖時(shí)間（30ms）和多次脈沖（3 次）條件下，細(xì)胞死亡率可超過(guò) 50%。而在優(yōu)化后的條件（200V/cm、20ms、2 次）下，細(xì)胞活力仍能保持在 70% - 80%，表明該條件下細(xì)胞毒性相對(duì)較低。

電場(chǎng)強(qiáng)度是影響轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的關(guān)鍵因素。適當(dāng)提高電場(chǎng)強(qiáng)度可增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn) DNA 進(jìn)入細(xì)胞，但過(guò)高的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù)也與轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性密切相關(guān)。較短的脈沖時(shí)間可能不足以使 DNA 有效進(jìn)入細(xì)胞，而過(guò)長(zhǎng)的脈沖時(shí)間和過(guò)多的脈沖次數(shù)會(huì)增加細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)。

此外，細(xì)胞密度、DNA 濃度等因素也會(huì)對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞密度過(guò)低或過(guò)高都不利于轉(zhuǎn)染，合適的細(xì)胞密度（1×10? - 5×10?個(gè) /ml）能獲得較好的轉(zhuǎn)染效果。DNA 濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) DNA 聚集，影響轉(zhuǎn)染效率，而過(guò)低的 DNA 濃度則會(huì)使進(jìn)入細(xì)胞的 DNA 量不足，同樣影響轉(zhuǎn)染效果。