摘要

本文介紹了一種陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞親和分選方法及試劑盒，該方法通過構(gòu)建一種基于細(xì)胞膜表面定位熒光蛋白標(biāo)簽的親和分選系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的高效分選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，為基因功能研究提供了有力工具。

引言

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一種重要技術(shù)手段，它可以將外源DNA、RNA或其他生物大分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的研究和調(diào)控。然而，在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，如淋巴瘤/白血病細(xì)胞以及原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率往往較低，這限制了這些細(xì)胞為基礎(chǔ)的功能研究。因此，如何在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中進(jìn)一步提高陽性率成為關(guān)鍵問題。

目前，提高陽性細(xì)胞比例的策略主要包括抗生素藥物篩選、流式細(xì)胞熒光分選（FACS）和磁性細(xì)胞分選（MACS）等方法。然而，這些方法存在操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、儀器昂貴、細(xì)胞損傷大等局限性。因此，開發(fā)一種操作快速、簡(jiǎn)單，成本低，適用性廣，并且對(duì)細(xì)胞干擾較小的富集轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的方法顯得尤為重要。

本研究旨在構(gòu)建一種基于磁珠親和分選的細(xì)胞分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)快速、高效的富集轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞。通過構(gòu)建一種可高效分選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的親和分選系統(tǒng)，在表達(dá)載體上編碼融合了膜定位信號(hào)、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，熒光蛋白和膜定位信號(hào)在轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞融合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的高效分選。

材料與方法

材料

1. 細(xì)胞株：Lenti-X293T細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞22Rv1、白血病細(xì)胞K-562及Jurkat細(xì)胞。

2. 表達(dá)載體：包含膜定位信號(hào)、熒光蛋白及親和分選標(biāo)簽的編碼序列的質(zhì)粒載體，如pEGFP-C2。

3. 磁珠：Magrose Strep-Tactin磁珠。

4. 試劑：某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、某品牌DPBS溶液、某品牌BSA。

5. 儀器：某品牌流式細(xì)胞儀、某品牌激光共聚焦熒光顯微鏡。

方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將Lenti-X293T細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞22Rv1、白血病細(xì)胞K-562及Jurkat細(xì)胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2. 基因構(gòu)建：通過PCR擴(kuò)增目的基因，并克隆至載體pEGFP-C2中，構(gòu)建包含膜定位信號(hào)、親和分選標(biāo)簽及熒光蛋白的表達(dá)框。具體步驟如下：

• 使用SignalP-5.0 Server在線分析獲取膜定位信號(hào)的編碼序列以及信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。

• 通過多重PCR將膜定位信號(hào)、親和分選標(biāo)簽及熒光蛋白的編碼序列融合，并通過AgeI/BglII酶切連接的方式克隆到pEGFP-C2載體中。

3. 轉(zhuǎn)染：采用某品牌脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體導(dǎo)入細(xì)胞中。

4. 親和分選：

• 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與Magrose Strep-Tactin磁珠孵育，使磁珠與細(xì)胞表面的親和標(biāo)簽結(jié)合。

• 通過外加磁場(chǎng)或自然沉降方式固定磁珠-細(xì)胞復(fù)合物。

• 使用溫和的洗脫緩沖液（含有0.05~0.15%BSA的DPBS溶液）將結(jié)合的細(xì)胞從磁珠上釋放出來，實(shí)現(xiàn)陽性細(xì)胞的親和分選。

5. 檢測(cè)與定量：

• 使用某品牌流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選前后細(xì)胞的陽性率。

• 通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察不同分選標(biāo)簽在細(xì)胞膜外層的定位情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 分選標(biāo)簽的細(xì)胞膜定位：將六種不同分選標(biāo)簽的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Lenti-X293T細(xì)胞，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，六種基于TST-EGFP的分選標(biāo)簽分子都可以高水平的表達(dá)并且有效的定位到細(xì)胞膜上。其中，三種GPI膜錨定類型的分選標(biāo)簽不僅具有良好的膜定位效果，并且細(xì)胞擁有正常的形態(tài)。

2. 轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的親和分選：將六種分選標(biāo)簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到三種細(xì)胞中，包括懸浮生長(zhǎng)的白血病細(xì)胞K-562，貼壁生長(zhǎng)的Lenti-X293T細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞22Rv1，使用Strep-Tactin磁珠分選陽性細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同變體對(duì)陽性細(xì)胞的分選效率。結(jié)果表明，六種分選標(biāo)簽在不同細(xì)胞系中均表現(xiàn)出了有效的富集轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的能力。尤其是基于GPI膜錨定的三種分選標(biāo)簽（TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，TST-EGFP-GPI CEAM7），其富集陽性細(xì)胞的能力顯著高于基于跨膜結(jié)構(gòu)域的分選標(biāo)簽。

3. 難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選效果：在難轉(zhuǎn)染的Jurkat白血病細(xì)胞中對(duì)三種基于GPI膜錨定分選標(biāo)簽進(jìn)行了轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這三種分選標(biāo)簽也表現(xiàn)出了高效的陽性細(xì)胞分離能力。經(jīng)過分選，TST-EGFP-GPI BY55，TST-EGFP-GPI DAF，和TST-EGFP-GPI CEAM7三種分選標(biāo)簽可將陽性細(xì)胞比例從13%分別提高到67%，77%和63%。

4. 分選效率的優(yōu)化：通過自然沉降的方式而不是依賴外部磁場(chǎng)的作用分離結(jié)合了細(xì)胞的磁珠，發(fā)現(xiàn)在K-562細(xì)胞中經(jīng)過TST-EGFP-GPI BY55分選標(biāo)簽富集之后，轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的比例達(dá)到95%以上。

討論

本研究構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細(xì)胞分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達(dá)載體上編碼融合了膜定位信號(hào)、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號(hào)在轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞融合表達(dá)?；谠撚H和分選系統(tǒng)，膜定位信號(hào)將熒光蛋白定位到細(xì)胞膜外表面，確保了技術(shù)人員可以直觀的通過流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡來評(píng)估轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞比例。

親和標(biāo)簽的使用讓技術(shù)人員可以通過磁珠分選的方式來快速高效的分離轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞。在本研究中，Twin-Strep-tag（TST）作為一種理想的親和標(biāo)簽短肽，與Strep-Tactin蛋白具有更高的親和力，被融合到綠色熒光蛋白分子的N端，作為親和分選標(biāo)簽分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于GPI膜錨定的分選標(biāo)簽具有更高的富集陽性細(xì)胞的能力。

此外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞損傷小、適用性廣。與現(xiàn)有的流式細(xì)胞熒光分選（FACS）和磁性細(xì)胞分選（MACS）等方法相比，該系統(tǒng)不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，實(shí)驗(yàn)成本低，且操作簡(jiǎn)便。通過調(diào)整磁珠的使用量即可在同一時(shí)間和批次處理不同數(shù)量級(jí)的細(xì)胞樣品，省時(shí)省力，且通量幾乎不受限制。

在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，該系統(tǒng)也表現(xiàn)出了高效的陽性細(xì)胞分離能力。這對(duì)于以難轉(zhuǎn)染細(xì)胞為基礎(chǔ)的功能研究具有重要意義。通過該系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中基因遞送效率的顯著提高，為后續(xù)的基因功能研究提供了有力工具。

研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于構(gòu)建了一種基于細(xì)胞膜表面定位熒光蛋白標(biāo)簽的親和分選系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的高效分選。該系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，為基因功能研究提供了有力工具。

在應(yīng)用前景方面，該系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于各種類型的實(shí)驗(yàn)研究，包括基因過表達(dá)分析、基因敲降分析、報(bào)告基因分析、基因編輯分析以及相關(guān)的細(xì)胞功能研究實(shí)驗(yàn)等。通過將分選標(biāo)簽的表達(dá)框插入到其他類型的載體上，即可將該轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的分選方法應(yīng)用于不同類型的實(shí)驗(yàn)研究。

此外，該系統(tǒng)還可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如基因組編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）、高通量測(cè)序技術(shù)等，進(jìn)一步拓展其在基因功能研究中的應(yīng)用范圍。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種基于磁珠親和分選的細(xì)胞分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的高效分選。該系統(tǒng)通過在表達(dá)載體上編碼融合了膜定位信號(hào)、親和標(biāo)簽標(biāo)記的熒光蛋白，使熒光蛋白和膜定位信號(hào)在轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞融合表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞損傷小、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，為基因功能研究提供了有力工具。

在未來的研究中，將進(jìn)一步優(yōu)化該系統(tǒng)，提高其分選效率和穩(wěn)定性。同時(shí)，將探索該系統(tǒng)在更多類型細(xì)胞中的應(yīng)用，以及與其他技術(shù)相結(jié)合的可能性，為基因功能研究提供更加全面和深入的工具和方法。