摘要

構(gòu)建穩(wěn)定表達人源性肝細胞生長因子（HGF）的細胞株。通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建HGF表達載體，利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中。采用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，并通過qPCR、Western blot和ELISA等方法驗證HGF的表達。結(jié)果表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達HGF的細胞株，為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

引言

肝細胞生長因子（HGF）是一種多功能的細胞因子，在組織修復(fù)、再生和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。近年來，HGF在肝臟疾病治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力備受關(guān)注。然而，HGF的穩(wěn)定表達和純化一直是制約其研究和應(yīng)用的瓶頸。構(gòu)建穩(wěn)定表達HGF的細胞株不僅可為HGF的功能研究提供可靠工具，還可為大規(guī)模生產(chǎn)重組HGF奠定基礎(chǔ)。本研究旨在通過分子克隆和細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達人源性HGF的細胞株，為HGF的相關(guān)研究和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用HEK293細胞系由某實驗室提供。HGF基因序列從某數(shù)據(jù)庫中獲取。pcDNA3.1載體、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等分子克隆試劑均使用某試劑。細胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基（某試劑），添加10%胎牛血清（某試劑）。G418篩選抗生素使用某試劑。qPCR試劑盒、Western blot相關(guān)試劑和ELISA檢測試劑盒均使用某試劑。

1.2 HGF表達載體構(gòu)建

根據(jù)HGF基因序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增獲得HGF編碼序列。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用EcoRI和XhoI進行雙酶切，使用DNA連接酶將HGF片段插入載體多克隆位點。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與篩選

將HEK293細胞接種于6孔板，待細胞密度達到80%時進行轉(zhuǎn)染。使用威尼德電穿孔儀，將構(gòu)建好的HGF表達載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，更換含G418（800 μg/mL）的篩選培養(yǎng)基。每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染對照組細胞全部死亡。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的鑒定

采用qPCR檢測HGF mRNA表達水平。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用HGF特異性引物進行qPCR分析。Western blot檢測HGF蛋白表達。收集細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后使用HGF特異性抗體進行檢測。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中HGF的分泌水平。按照某試劑ELISA試劑盒說明書進行操作。

二、結(jié)果與分析

2.1 HGF表達載體構(gòu)建

通過PCR擴增獲得了約2.2 kb的HGF編碼序列。經(jīng)雙酶切和連接反應(yīng)，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HGF重組質(zhì)粒。菌落PCR和測序結(jié)果證實HGF基因正確插入載體中，且閱讀框正確。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

G418篩選2周后，未轉(zhuǎn)染對照組細胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染組細胞形成多個抗性克隆。挑取10個單克隆擴大培養(yǎng)，獲得潛在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

2.3 HGF表達檢測

qPCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中HGF mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）。Western blot分析顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株在約90 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期HGF蛋白大小一致。ELISA檢測表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株培養(yǎng)上清中HGF濃度顯著高于對照組（P<0.01），達到約500 ng/mL。

三、討論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達人源性HGF的HEK293細胞株。通過分子克隆技術(shù)，我們將HGF基因插入pcDNA3.1載體，利用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染。G418篩選獲得了多個抗性克隆，qPCR、Western blot和ELISA結(jié)果一致證實了HGF在mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定表達。

與以往研究相比，本研究采用的pcDNA3.1載體具有較高的表達效率和穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的使用顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株奠定了基礎(chǔ)。獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株HGF表達水平較高，為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用提供了可靠工具。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，僅選擇了HEK293細胞作為宿主細胞，未來可嘗試在其他細胞系中構(gòu)建HGF穩(wěn)定表達細胞株。其次，HGF的表達水平和活性還需進一步優(yōu)化和驗證。未來研究可探索不同啟動子、信號肽等對HGF表達和分泌的影響，以提高HGF的產(chǎn)量和生物活性。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達人源性HGF的HEK293細胞株。通過分子克隆、電穿孔轉(zhuǎn)染和G418篩選，獲得了高效表達HGF的穩(wěn)定細胞株。該細胞株的建立為HGF的功能研究、藥物篩選以及重組HGF的生產(chǎn)提供了重要工具。未來研究可進一步優(yōu)化HGF表達條件，探索其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用潛力。

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