摘要

本研究旨在優(yōu)化電穿孔法轉(zhuǎn)染人原代成纖維細(xì)胞的條件，以提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。通過調(diào)整電壓、脈沖時間和細(xì)胞密度等參數(shù)，我們確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。實驗結(jié)果表明，在特定條件下，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，同時細(xì)胞存活率保持在較高水平。本研究為電穿孔法在基因功能研究和基因治療中的應(yīng)用提供了重要參考。

引言

人原代成纖維細(xì)胞在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和基因功能研究中具有重要應(yīng)用。然而，由于其難以轉(zhuǎn)染的特性，如何高效地將外源基因?qū)脒@些細(xì)胞成為研究中的一大挑戰(zhàn)。電穿孔法作為一種非病毒轉(zhuǎn)染方法，因其高效性和簡便性而備受關(guān)注。然而，電穿孔條件的優(yōu)化對于提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率至關(guān)重要。本研究旨在通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，為人原代成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染提供最佳條件。

實驗部分

材料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)

人原代成纖維細(xì)胞從皮膚活檢中分離，并在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。

質(zhì)粒制備

實驗使用的質(zhì)粒為pEGFP-N1，該質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因。質(zhì)粒通過某試劑盒提取，并用分光光度計測定其濃度和純度。

電穿孔條件優(yōu)化

電穿孔實驗使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行。實驗設(shè)計如下：

1. 電壓優(yōu)化：設(shè)置電壓范圍為100V至300V，間隔50V，每個電壓條件下進(jìn)行三次重復(fù)實驗。

2. 脈沖時間優(yōu)化：在最佳電壓條件下，設(shè)置脈沖時間為5ms至20ms，間隔5ms，每個時間條件下進(jìn)行三次重復(fù)實驗。

3. 細(xì)胞密度優(yōu)化：在最佳電壓和脈沖時間條件下，設(shè)置細(xì)胞密度為1×10^6至5×10^6 cells/mL，間隔1×10^6 cells/mL，每個密度條件下進(jìn)行三次重復(fù)實驗。

轉(zhuǎn)染效率檢測

轉(zhuǎn)染后24小時，使用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，并通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞存活率檢測

轉(zhuǎn)染后24小時，使用某試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，通過臺盼藍(lán)染色法計算細(xì)胞存活率。

結(jié)果

電壓優(yōu)化

實驗結(jié)果表明，隨著電壓的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高，但當(dāng)電壓超過250V時，細(xì)胞存活率顯著下降。因此，250V被確定為最佳電壓。

脈沖時間優(yōu)化

在250V電壓下，脈沖時間為10ms時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，同時細(xì)胞存活率保持在80%以上。因此，10ms被確定為最佳脈沖時間。

細(xì)胞密度優(yōu)化

在250V電壓和10ms脈沖時間條件下，細(xì)胞密度為3×10^6 cells/mL時，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞存活率也保持在較高水平。因此，3×10^6 cells/mL被確定為最佳細(xì)胞密度。

討論

本研究通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，確定了人原代成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。實驗結(jié)果表明，電壓、脈沖時間和細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率有顯著影響。在最佳條件下，轉(zhuǎn)染效率顯著提高，同時細(xì)胞存活率保持在較高水平。這些結(jié)果為電穿孔法在基因功能研究和基因治療中的應(yīng)用提供了重要參考。

結(jié)論

本研究成功優(yōu)化了電穿孔法轉(zhuǎn)染人原代成纖維細(xì)胞的條件，確定了最佳電壓、脈沖時間和細(xì)胞密度。這些優(yōu)化條件顯著提高了轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率，為人原代成纖維細(xì)胞的基因功能研究和基因治療提供了有效工具。

參考文獻(xiàn)

1. 人永生化表皮細(xì)胞HaCaT電轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化[J].徐珊;杜沖;馬艷民;謝宏俊;高楊;石琦;王新陽;賀大林;郭鵬,西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）.2014,第4期

2. 人成纖維細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法比較[J].蘆小燕;解慧琪;李莉;智偉;陳曉禾;鄧力,四川大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版.2008,第4期

3. An efficient method for electroporation of small interfering RNAs into ENCODE project tier 1 GM12878 and K562 cell lines[J].,Journal of biomolecular techniques: JBT.2015,第4期

4. Arterial complication of irreversible electroporation procedure for locally advanced pancreatic cancer.[J].Yahya; Ekici;Tugan; Tezcaner;Hüseyin Onur; Ayd?n;Fatih; Boyvat;G?khan; Moray,World Journal of Gastrointestinal Oncology.2016,第10期

5. Direct reprogramming of mouse fibroblasts into cardiac myocytes[J].Inagawa;K.;Ieda;M.,Journal of cardiovascular translational research.2013,第1期

6. Episomal-based generation of an iPS cell line from human fetal foreskin fibroblasts.[J].Peggy; Matz;James; Adjaye,Stem cell research.2016,第期

7. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors.[J].Michalina; Hanzel;Richard J T; Wingate;Thomas; Butts,Journal of visualized experiments: JoVE.2015,第期

8. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions[J].Malin Kele;Kelly Day;Harriet R?nnholm;Jens Schuster;Niklas Dahl;Anna Falk,Stem cell research.2016,第3期

9. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells.[J].Artur; Cie?lar-Pobuda;Mehrdad; Rafat;Viktoria; Knoflach;Magdalena; Skonieczna;Andrzej; Hudecki;Andrzej; Ma?ecki;El?bieta; Urasińska;Seaid; Ghavami;Marek J; ?os,Oncotarget.2016,第27期