摘要

建立高效的大鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，并優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。通過機(jī)械分離結(jié)合酶消化法獲取原代神經(jīng)干細(xì)胞，利用含某試劑的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并通過威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)外源基因的高效轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，分離的細(xì)胞具備自我更新及多向分化潛能，電穿孔后轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%以上。該方法為神經(jīng)干細(xì)胞的功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。

引言

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的體外培養(yǎng)與基因編輯技術(shù)是研究神經(jīng)發(fā)育、疾病機(jī)制及再生醫(yī)學(xué)的重要手段。目前，原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離常面臨純度低、存活率不穩(wěn)定等問題，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法（如脂質(zhì)體法）對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低。電穿孔技術(shù)因其高效、適用范圍廣的特點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)，但其參數(shù)優(yōu)化仍需進(jìn)一步探索。

本研究以大鼠胎腦為材料，系統(tǒng)優(yōu)化神經(jīng)干細(xì)胞的分離流程，結(jié)合威尼德電穿孔儀探索轉(zhuǎn)染條件，旨在建立一套穩(wěn)定、高效的實(shí)驗(yàn)體系，為后續(xù)基因功能研究及疾病模型構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：孕14天SD大鼠，由某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

主要試劑：某試劑品牌神經(jīng)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基（含EGF、bFGF）、胰酶消化液、多聚賴氨酸、DNA質(zhì)粒（GFP標(biāo)記）。

儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀、倒置熒光顯微鏡、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)。

2. 神經(jīng)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取材與預(yù)處理：斷頸法處死孕鼠，無(wú)菌條件下取出胎鼠腦組織，置于預(yù)冷的某試劑平衡鹽溶液中。

機(jī)械消化：剪碎組織至1 mm3以下，加入0.125%胰酶，37℃消化15分鐘，期間震蕩3次。

終止消化與離心：加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

細(xì)胞懸液制備：用某試劑無(wú)血清培養(yǎng)基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF）重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過濾，調(diào)整密度至1×10? cells/mL。

原代培養(yǎng)：接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO?條件下靜置培養(yǎng)，每3天半量換液。

3. 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定與傳代

神經(jīng)球形成觀察：培養(yǎng)第5天，于倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球形態(tài)及直徑。

免疫熒光鑒定：收集神經(jīng)球，固定后標(biāo)記Nestin（干細(xì)胞標(biāo)志物），威尼德紫外交聯(lián)儀處理樣本，熒光顯微鏡下分析陽(yáng)性率。

傳代擴(kuò)增：機(jī)械吹打神經(jīng)球至單細(xì)胞懸液，按1:3比例傳代，連續(xù)培養(yǎng)3代評(píng)估增殖穩(wěn)定性。

4. 電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)優(yōu)化

質(zhì)粒預(yù)處理：使用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒獲取高純度GFP質(zhì)粒，濃度調(diào)整為1 μg/μL。

電穿孔參數(shù)設(shè)置：取第3代神經(jīng)干細(xì)胞，重懸于電穿孔緩沖液（某試劑），與質(zhì)?；旌虾蠹尤胪岬码姶┛變x專用電擊杯，設(shè)置電壓（200 V、300 V、400 V）、脈沖時(shí)間（5 ms、10 ms、15 ms）及脈沖次數(shù)（1次、2次）進(jìn)行條件篩選。

轉(zhuǎn)染后處理：電擊后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，37℃靜置10分鐘，接種于24孔板，24小時(shí)后觀察GFP表達(dá)效率及細(xì)胞存活率。

5. 分子檢測(cè)技術(shù)

qPCR驗(yàn)證基因表達(dá)：提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RNA，某試劑反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA，檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)水平。

Western blot分析：裂解細(xì)胞后，使用某試劑蛋白提取試劑，威尼德分子雜交儀完成轉(zhuǎn)膜及抗體孵育。

結(jié)果與討論

1. 神經(jīng)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)

原代培養(yǎng)第3天可見直徑50-100 μm的神經(jīng)球，Nestin陽(yáng)性率>90%，傳代后細(xì)胞增殖速率穩(wěn)定，證實(shí)分離體系可靠。

無(wú)血清培養(yǎng)基結(jié)合生長(zhǎng)因子可有效抑制分化，維持干細(xì)胞特性。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

電壓300 V、脈沖時(shí)間10 ms、單次脈沖條件下，轉(zhuǎn)染效率達(dá)65.3±4.7%，細(xì)胞存活率>80%。過高電壓（400 V）導(dǎo)致存活率顯著下降（<50%）。

威尼德電穿孔儀的方形波脈沖模式可減少細(xì)胞損傷，較傳統(tǒng)指數(shù)衰減波更適用于神經(jīng)干細(xì)胞。

3. 基因表達(dá)驗(yàn)證

GFP熒光信號(hào)在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后顯著表達(dá)，qPCR顯示外源基因mRNA水平上調(diào)3.5倍，Western blot證實(shí)蛋白表達(dá)成功。

結(jié)論

本研究成功建立了大鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的高效分離培養(yǎng)體系，并通過威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)了外源基因的高效轉(zhuǎn)染。優(yōu)化的電穿孔參數(shù)（300 V, 10 ms, 單次脈沖）在保證細(xì)胞存活的同時(shí)顯著提升轉(zhuǎn)染效率，為神經(jīng)干細(xì)胞的基因功能研究及臨床應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

1. 構(gòu)建EGFP-PDX-1融合表達(dá)載體電穿孔轉(zhuǎn)染大鼠胎肝干細(xì)胞的研究 [J] . 孫冰 ,孫曉艷 ,安靚 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2006,第006期

2. 大鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) [J] . 李雪玲 ,扈廷茂 ,蘇慧敏 . 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版 . 2004,第5期

3. 人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定 [J] . 方慶 ,朱慶豐 ,尹國(guó)才 . 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) . 2012,第027期

4. 大鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)分化及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 劉建新 ,王曉峰 ,張榮軍 . 臨床神經(jīng)外科雜志 . 2012,第003期

5. 分離大鼠胎,新生磊鼠和新生小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng) [J] . 吳瑞煒 ,賈友蘇 . 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 1991,第001期

6. 山羊胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 [C] . 高靜 ,倉(cāng)明 . 第七次全國(guó)動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨新疆畜牧科學(xué)院第六次學(xué)術(shù)年會(huì) . 2013

7. 人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定 [A] . 方慶 . 2012