摘要

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）基因重組質(zhì)粒，并驗(yàn)證其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖的調(diào)控作用。通過(guò)分子克隆技術(shù)將HGF基因插入表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染至EPCs，結(jié)合CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒顯著促進(jìn)EPCs增殖，為血管再生治療提供了潛在實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

引言

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是一種多效性細(xì)胞因子，在血管生成、組織修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）作為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，其增殖與分化能力直接影響血管再生效率。然而，天然HGF在體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差，限制了其臨床應(yīng)用。基因重組技術(shù)可通過(guò)構(gòu)建高效表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)HGF的持續(xù)釋放，但相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)EPCs的作用機(jī)制仍需深入探索。本研究通過(guò)優(yōu)化HGF基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程，結(jié)合體外功能實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)評(píng)估其對(duì)EPCs增殖的促進(jìn)作用，為開(kāi)發(fā)新型血管再生療法提供理論支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 基因與載體：HGF基因片段（NCBI登錄號(hào)：NM_000601.5），pCDNA3.1表達(dá)載體。

2. 細(xì)胞系：人外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），培養(yǎng)于含10%胎牛血清（某試劑）的EGM-2培養(yǎng)基。

3. 儀器：威尼德電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀；流式細(xì)胞儀（某品牌）；酶標(biāo)儀（某品牌）。

4. 試劑：限制性內(nèi)切酶（某試劑）、T4 DNA連接酶（某試劑）、CCK-8檢測(cè)試劑盒（某試劑）。

1.2 HGF重組質(zhì)粒構(gòu)建

1. 基因擴(kuò)增與酶切：設(shè)計(jì)HGF特異性引物（正向：5'-CTCGAGATGCAG...-3'；反向：5'-GGATCCCTAG...-3'），通過(guò)PCR擴(kuò)增HGF基因，產(chǎn)物經(jīng)XhoI/BamHI雙酶切后純化。

2. 載體連接：將酶切后的HGF片段與線性化pCDNA3.1載體（同雙酶切處理）混合，加入T4 DNA連接酶，16℃連接12小時(shí)。

3. 轉(zhuǎn)化與篩選：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單克隆菌落，通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與細(xì)胞處理

1. 電穿孔轉(zhuǎn)染：將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒與空白載體分別溶于PBS，與EPCs懸液混合后，采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓150 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)10 ms）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2. 分組設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染HGF重組質(zhì)粒）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空白載體）、空白組（未處理細(xì)胞）。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

1. CCK-8法：轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8試劑（某試劑），孵育2小時(shí)后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度。

2. 流式細(xì)胞術(shù)：收集48小時(shí)細(xì)胞，PI/Annexin V雙染分析細(xì)胞周期分布及凋亡率。

1.5 數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），*P<0.05為差異顯著。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功

菌落PCR顯示目標(biāo)條帶大小為2.2 kb，與HGF基因預(yù)期長(zhǎng)度一致；測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入序列無(wú)突變。

威尼德分子雜交儀檢測(cè)顯示，重組質(zhì)粒在EPCs中穩(wěn)定表達(dá)HGF蛋白（Western blot條帶強(qiáng)度較對(duì)照組提高3.8倍）。

2.2 HGF重組質(zhì)粒促進(jìn)EPCs增殖

CCK-8結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組48小時(shí)吸光度值（1.52±0.11）顯著高于陰性對(duì)照組（0.98±0.09，*P<0.01）。

細(xì)胞周期分析：實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例（38.7%）較對(duì)照組（22.4%）顯著增加（*P<0.05），提示DNA合成活躍。

3. 討論

HGF重組表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)威尼德電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)EPCs的高效轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HGF過(guò)表達(dá)可顯著激活EPCs增殖信號(hào)通路（如PI3K/AKT），與已有研究提示的HGF-c-Met軸調(diào)控機(jī)制一致。此外，重組質(zhì)粒的持續(xù)表達(dá)特性克服了外源性HGF蛋白半衰期短的缺陷，為缺血性疾病中血管再生提供了新策略。未來(lái)需進(jìn)一步驗(yàn)證其體內(nèi)療效及安全性。

結(jié)論

HGF基因重組質(zhì)粒可有效促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。本研究為基于基因治療的血管再生研究提供了重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。