摘要

在優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人組織因子的工藝條件。通過(guò)密碼子優(yōu)化、發(fā)酵參數(shù)調(diào)控及純化策略改進(jìn)，顯著提高了目標(biāo)蛋白產(chǎn)量與純度。采用某品牌威尼德電穿孔儀進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化，結(jié)合親和層析與分子篩純化，最終獲得高活性重組人組織因子，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

引言

人組織因子（human Tissue Factor, hTF）是凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵起始因子，在止血、血栓性疾病及腫瘤生物學(xué)中具有重要作用。重組hTF的生產(chǎn)對(duì)于基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用至關(guān)重要。畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有蛋白折疊準(zhǔn)確、翻譯后修飾完善及高密度發(fā)酵等優(yōu)勢(shì)，已成為重組蛋白生產(chǎn)的理想平臺(tái)。

然而，hTF在畢赤酵母中的表達(dá)仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括表達(dá)量低、蛋白降解及純化困難等問(wèn)題。研究系統(tǒng)優(yōu)化了hTF的密碼子、發(fā)酵條件及純化工藝，旨在建立一套高效、穩(wěn)定的生產(chǎn)流程。通過(guò)引入某品牌威尼德電穿孔儀提高轉(zhuǎn)化效率，并采用多步層析策略提升蛋白純度，為大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量hTF提供了可靠方案。

材料與方法

1. 菌株與載體

實(shí)驗(yàn)選用畢赤酵母GS115菌株作為表達(dá)宿主。hTF基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后克隆至pPIC9K載體，該載體含有AOX1啟動(dòng)子及His6標(biāo)簽序列，便于誘導(dǎo)表達(dá)與純化。

2. 表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的hTF基因，利用某試劑限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，隨后連接至線(xiàn)性化pPIC9K載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

3. 畢赤酵母轉(zhuǎn)化

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒線(xiàn)性化后，采用某品牌威尼德電穿孔儀進(jìn)行畢赤酵母電轉(zhuǎn)化。電穿孔參數(shù)設(shè)置為：電壓1500 V，電容25 μF，電阻200 Ω。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于MD平板（不含組氨酸），30℃培養(yǎng)3-5天。通過(guò)G418抗性篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。

4. 表達(dá)條件優(yōu)化

4.1 搖瓶水平篩選

挑取單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=2-6。離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇）誘導(dǎo)表達(dá)。每24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5%，持續(xù)誘導(dǎo)96小時(shí)。

4.2 發(fā)酵罐水平優(yōu)化

采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。發(fā)酵分為三個(gè)階段：

甘油批式階段：初始甘油濃度4%，溶解氧（DO）維持在30%；

甘油補(bǔ)料階段：控制甘油流加速率，維持DO在20%；

甲醇誘導(dǎo)階段：梯度增加甲醇濃度（0.5%-2%），DO控制在10%。

定期取樣檢測(cè)菌體密度（OD600）、蛋白表達(dá)量及活性。

5. 蛋白純化

5.1 粗提物制備

發(fā)酵液離心收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，用某試劑Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）透析。

5.2 親和層析

將透析樣品上樣至Ni-NTA親和柱，結(jié)合緩沖液為20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含300 mM NaCl、10 mM咪唑），洗脫緩沖液含250 mM咪唑。收集洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)純度。

5.3 分子篩層析

進(jìn)一步采用Superdex 75分子篩柱進(jìn)行精純。以PBS（pH 7.4）為流動(dòng)相，流速0.5 mL/min。收集主峰，測(cè)定蛋白濃度與活性。

6. 分析檢測(cè)

6.1 SDS-PAGE與Western blot

采用12% SDS-PAGE分析蛋白純度，某試劑考馬斯亮藍(lán)染色。Western blot使用抗His標(biāo)簽一抗及HRP標(biāo)記二抗，某品牌威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行膜固定。

6.2 蛋白活性測(cè)定

通過(guò)凝血時(shí)間測(cè)定評(píng)估hTF活性。將純化蛋白與乏血小板血漿混合，記錄纖維蛋白形成時(shí)間，以商業(yè)hTF為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

結(jié)果

1. 表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

密碼子優(yōu)化后的hTF基因成功克隆至pPIC9K載體，測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)突變。某品牌威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率達(dá)1×10^5 cfu/μg DNA，顯著高于傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法。

2. 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

搖瓶水平篩選顯示，甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)時(shí)表達(dá)量最高（約120 mg/L）。發(fā)酵罐優(yōu)化后，通過(guò)控制DO與甲醇梯度，最終產(chǎn)量提升至450 mg/L，較初始條件提高3.75倍。

3. 純化工藝評(píng)價(jià)

Ni-NTA親和層析一步純化后，蛋白純度達(dá)85%；經(jīng)分子篩精純，最終純度>95%，比活性為1.2×10^5 U/mg。SDS-PAGE與Western blot證實(shí)目標(biāo)蛋白大小正確（約47 kDa），無(wú)降解條帶。

4. 蛋白活性分析

純化hTF可顯著縮短血漿凝血時(shí)間（從180 s降至45 s），活性與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)（P>0.05）。

討論

本研究通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化畢赤酵母表達(dá)hTF的全流程，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)高質(zhì)的目標(biāo)。密碼子優(yōu)化解決了異源表達(dá)效率低的問(wèn)題；某品牌威尼德電穿孔儀的應(yīng)用大幅提升了轉(zhuǎn)化效率；而發(fā)酵參數(shù)的精細(xì)調(diào)控（如DO與甲醇梯度）則有效平衡了菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)。

在純化工藝中，Ni-NTA親和層析結(jié)合分子篩的策略兼顧效率與成本，避免了傳統(tǒng)離子交換層析的復(fù)雜操作。值得注意的是，hTF的凝血活性高度依賴(lài)其正確折疊，畢赤酵母的真核分泌系統(tǒng)為此提供了保障。

結(jié)論

研究建立了一套高效的畢赤酵母表達(dá)與純化hTF的工藝。通過(guò)密碼子優(yōu)化、發(fā)酵參數(shù)調(diào)控及多步層析，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)（450 mg/L）、高純（>95%）與高活性（1.2×10^5 U/mg）的重組hTF制備。該工藝穩(wěn)定可靠，為臨床級(jí)hTF的生產(chǎn)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1. 組織因子膜外區(qū)融合蛋白基因的表達(dá)及產(chǎn)物的分離純化與活性分析[J].關(guān)明;呂元;倪贊明;王云貴;戴金風(fēng);陳常慶,中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào).2001,第1期

2. 可溶性組織因子的基因克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究[J].于敏;王羽雄;顧銀良;宋后燕,藥物生物技術(shù).2002,第3期

3. Expression of human soluble tissue factor in yeast and enzymatic properties of its complex with factor VIIa.[J].Y; Shigematsu;T; Miyata;S; Higashi;T; Miki;J E; Sadler;S; Iwanaga,The Journal of biological chemistry.1992,第30期

4. Factor VIII-bypassing activity of bovine tissue factor using the canine hemophilic model.[J].O'Brien D P;Giles A R;Tate K M;Vehar G A,Journal of Clinical Investigation.1988,第期

5. High level expression of recombinant human tissue factor in Chinese hamster ovary cells as a human thromboplastin.[J].A; Rehemtulla;M; Pepe;T S; Edgington,Thrombosis and haemostasis.1991,第5期

6. Production of human tissue factor using the Pichia pastoris expression system[J].Austin AJ.;Jones CE.;Van Heeke G.,Protein Expression & Purification.1998,第1期