摘要

研究通過溶膠-凝膠法合成硅納米顆粒，并對(duì)其表面進(jìn)行氨基化修飾，探究其作為基因載體的性能。實(shí)驗(yàn)表明，氨基化硅納米顆粒粒徑均一（50±5 nm），表面電位+28 mV，可高效負(fù)載質(zhì)粒DNA（負(fù)載率>90%）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，其轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%，且細(xì)胞存活率高于85%。結(jié)果表明，氨基化修飾顯著提升基因遞送能力，為基因治療載體開發(fā)提供新思路。

引言

基因治療作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)，其關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于開發(fā)安全高效的基因遞送載體。病毒載體雖轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性和插入突變風(fēng)險(xiǎn)；而非病毒載體如脂質(zhì)體、聚合物等，常受限于低負(fù)載效率或細(xì)胞毒性。近年來，硅納米顆粒因其生物相容性高、表面易功能化等特點(diǎn)備受關(guān)注。氨基化修飾可通過靜電吸附增強(qiáng)核酸負(fù)載能力，同時(shí)促進(jìn)溶酶體逃逸，提升基因表達(dá)效率。

研究以硅納米顆粒為基礎(chǔ)，通過氨基化修飾優(yōu)化其表面化學(xué)特性，系統(tǒng)評(píng)估其基因負(fù)載能力、細(xì)胞相容性及轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)采用溶膠-凝膠法結(jié)合硅烷偶聯(lián)劑修飾，結(jié)合多種表征手段（如透射電鏡、動(dòng)態(tài)光散射）驗(yàn)證顆粒性能，并通過體外細(xì)胞模型（HeLa細(xì)胞）驗(yàn)證其基因遞送效果。研究旨在為新型非病毒基因載體的設(shè)計(jì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

1. 試劑：硅酸四乙酯（某試劑）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（某試劑）、無水乙醇（某試劑）、質(zhì)粒DNA（pEGFP-N1，某試劑）。

2. 儀器：威尼德紫外交聯(lián)儀（用于DNA固定實(shí)驗(yàn)）、威尼德電穿孔儀（細(xì)胞轉(zhuǎn)染）、高速離心機(jī)、透射電子顯微鏡（TEM）、Zeta電位分析儀、熒光顯微鏡。

2. 硅納米顆粒的合成與氨基化修飾

步驟1：硅納米顆粒制備
采用溶膠-凝膠法：將10 mL無水乙醇與2 mL硅酸四乙酯混合，滴加1 mL氨水（pH=10.5），磁力攪拌（500 rpm，25℃）反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心（12,000 rpm，15 min）收集沉淀，超純水洗滌3次，冷凍干燥后獲得白色粉末狀硅納米顆粒。

步驟2：表面氨基化修飾
將100 mg硅納米顆粒分散于50 mL乙醇中，加入1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下70℃回流反應(yīng)12 h。反應(yīng)液離心純化，乙醇洗滌3次，凍干后得氨基化硅納米顆粒（Si-NH?）。

3. 材料表征

1. 形貌與粒徑：透射電鏡（TEM）觀察顯示，原始硅顆粒呈球形，粒徑約50 nm；氨基化修飾后粒徑略微增大至55 nm，表面包覆均勻。

2. 表面電位：Zeta電位分析表明，修飾后顆粒表面電位由-15 mV（未修飾）轉(zhuǎn)變?yōu)?28 mV，證實(shí)氨基成功接枝。

3. 傅里葉紅外光譜（FTIR）：在1550 cm?1處出現(xiàn)N-H彎曲振動(dòng)峰，1100 cm?1處為Si-O-Si特征峰，進(jìn)一步驗(yàn)證氨基化結(jié)構(gòu)。

4. 基因負(fù)載性能測(cè)試

4.1 DNA負(fù)載能力
將1 mg Si-NH?顆粒與0.1 mg質(zhì)粒DNA（pEGFP-N1）溶于PBS（pH=7.4），室溫孵育30 min。通過瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估負(fù)載效率：當(dāng)質(zhì)量比（顆粒:DNA）為10:1時(shí)，DNA條帶消失，表明負(fù)載率>90%。

4.2 負(fù)載復(fù)合物穩(wěn)定性
采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）監(jiān)測(cè)復(fù)合物體積變化：在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中孵育24 h，粒徑由60 nm增至65 nm（PDI<0.2），表明復(fù)合物穩(wěn)定性良好。

5. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

5.1 細(xì)胞毒性評(píng)估
將HeLa細(xì)胞接種于96孔板（密度1×10?/孔），分別加入不同濃度Si-NH?（0-200 μg/mL），培養(yǎng)24 h后CCK-8法檢測(cè)存活率。結(jié)果顯示，濃度≤100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率>85%；200 μg/mL時(shí)存活率降至75%。

5.2 轉(zhuǎn)染效率分析
使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將Si-NH?/DNA復(fù)合物（質(zhì)量比10:1）與HeLa細(xì)胞共孵育4 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)細(xì)胞比例，轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%；對(duì)比未修飾硅顆粒（效率<20%），氨基化修飾顯著提升基因遞送能力。

5.3 細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制
采用低溫（4℃）和網(wǎng)格蛋白抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩種條件下GFP表達(dá)率分別下降至15%和30%，表明內(nèi)吞途徑以網(wǎng)格蛋白依賴為主。

結(jié)果與討論

研究成功制備氨基化硅納米顆粒，其正電表面可高效吸附帶負(fù)電的DNA，并通過靜電作用促進(jìn)細(xì)胞膜吸附。透射電鏡與Zeta電位數(shù)據(jù)證實(shí)氨基化修飾的可行性，而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，修飾后的顆粒在低毒性范圍內(nèi)（≤100 μg/mL）可實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。

與文獻(xiàn)報(bào)道的脂質(zhì)體載體（轉(zhuǎn)染效率約50%）相比，Si-NH?體系表現(xiàn)出更高穩(wěn)定性與可重復(fù)性。此外，氨基化修飾可能通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)"促進(jìn)溶酶體逃逸，避免DNA降解，從而提升基因表達(dá)效率。

結(jié)論

研究證實(shí)氨基化硅納米顆粒具有優(yōu)異的基因負(fù)載能力和生物相容性，其轉(zhuǎn)染效率顯著高于未修飾體系。未來將進(jìn)一步優(yōu)化顆粒表面功能化策略（如PEG修飾延長(zhǎng)循環(huán)半衰期），并開展體內(nèi)抗腫瘤基因治療研究。該體系為非病毒載體開發(fā)提供了重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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