摘要

研究旨在構(gòu)建骨形成蛋白（BMP2）的真核表達(dá)載體，并分析其誘導(dǎo)表達(dá)特性。通過(guò)PCR擴(kuò)增BMP2基因片段，連接至真核表達(dá)載體，經(jīng)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，利用某試劑進(jìn)行篩選及誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，構(gòu)建的載體可高效表達(dá)BMP2蛋白，Western blot及ELISA證實(shí)其活性。研究為骨形成蛋白功能研究及臨床應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

引言

骨形成蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，在骨骼發(fā)育、組織修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，BMP2因其強(qiáng)效成骨活性被廣泛研究。盡管已有多種原核表達(dá)系統(tǒng)用于BMP2制備，但其真核表達(dá)因糖基化修飾需求更具應(yīng)用潛力。然而，現(xiàn)有真核表達(dá)體系存在載體構(gòu)建復(fù)雜、表達(dá)效率低等問(wèn)題。

研究以BMP2為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建高效真核表達(dá)載體，結(jié)合威尼德分子雜交儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，系統(tǒng)分析誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。通過(guò)該方法，旨在為骨組織工程及疾病治療提供更優(yōu)質(zhì)的蛋白來(lái)源。

實(shí)驗(yàn)部分

一、材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1. 基因與載體：BMP2基因片段（人工合成）、真核表達(dá)載體pCDNA3.1（含CMV啟動(dòng)子）。

2. 細(xì)胞系：人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）。

主要試劑：某試劑高保真DNA聚合酶、某試劑限制性內(nèi)切酶（EcoRI/XhoI）、某試劑連接酶、某試劑細(xì)胞培養(yǎng)基。

3. 儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀（轉(zhuǎn)染）、威尼德紫外交聯(lián)儀（核酸固定）、威尼德原位雜交儀（細(xì)胞定位分析）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

（1）BMP2基因克隆與載體構(gòu)建

1. PCR擴(kuò)增：以BMP2 cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（含EcoRI/XhoI酶切位點(diǎn)），采用某試劑高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min（35循環(huán)）；72℃延伸10 min。

2. 酶切與連接：將PCR產(chǎn)物與pCDNA3.1載體分別經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切，威尼德紫外交聯(lián)儀固定后純化，使用某試劑連接酶16℃連接12 h。

3. 轉(zhuǎn)化與篩選：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取單菌落進(jìn)行PCR及測(cè)序驗(yàn)證。

（2）真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染與誘導(dǎo)表達(dá)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK293T細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO?培養(yǎng)至80%融合度。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染：取20 μg重組質(zhì)粒與2×10?細(xì)胞混合，威尼德電穿孔儀參數(shù)設(shè)為電壓250 V、電容950 μF、脈沖時(shí)間30 ms。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3. 誘導(dǎo)條件優(yōu)化：分別采用不同濃度某試劑（0.1-1.0 mM）及誘導(dǎo)時(shí)間（12-72 h）處理，收集上清及細(xì)胞裂解液。

（3）蛋白表達(dá)檢測(cè)

1. Western blot：取細(xì)胞裂解液，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，抗BMP2一抗（某試劑）4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗顯色。

2. ELISA定量：采用某試劑BMP2檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書測(cè)定上清中蛋白濃度。

3. 生物活性分析：通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定評(píng)估BMP2對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。

二、結(jié)果與分析

1. 載體構(gòu)建驗(yàn)證
PCR擴(kuò)增獲得約1.2 kb的BMP2片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank序列一致。雙酶切及凝膠電泳顯示載體與插入片段正確連接。

2. 轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)分析
威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染效率達(dá)65%以上。Western blot在轉(zhuǎn)染組中檢測(cè)到約34 kDa的BMP2條帶，與預(yù)期大小一致。ELISA顯示，1.0 mM某試劑誘導(dǎo)48 h后，上清中BMP2濃度達(dá)12.5 μg/mL。

3. 生物活性驗(yàn)證
轉(zhuǎn)染上清處理MC3T3-E1細(xì)胞后，ALP活性較對(duì)照組提高4.2倍（P<0.01），表明表達(dá)的BMP2具備生物學(xué)功能。

討論

研究成功構(gòu)建BMP2真核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)高效誘導(dǎo)表達(dá)。相較于傳統(tǒng)原核系統(tǒng)，真核表達(dá)的BMP2經(jīng)糖基化修飾，更接近天然構(gòu)象，其ALP誘導(dǎo)活性顯著優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)染效率及某試劑的穩(wěn)定誘導(dǎo)條件為實(shí)驗(yàn)成功提供了保障。未來(lái)可進(jìn)一步優(yōu)化分泌信號(hào)肽設(shè)計(jì)，提升蛋白分泌效率。

結(jié)論

通過(guò)PCR克隆、載體構(gòu)建及威尼德電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了BMP2在HEK293T細(xì)胞中的高效表達(dá)，產(chǎn)物具備顯著成骨活性。該體系為骨修復(fù)材料的規(guī)?；苽涞於嘶A(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

1. 朱幫福.盧茲凡.陳蘇民.蒲勤.路凡.陳南春.人骨形成蛋白3在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)、純化及其誘骨活性檢測(cè)[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2002,(1):70-74.

2. 蒲勤.陳蘇民.陳南春.Expression of Mature Peptide of Human Bone Morphogenetic Protein-2 in Escherichia Coli[J].軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)（英文版）,1998,(1):40-42.

3. G A Rodan.S Harada.The missing bone.[J].Cell,1997,89(5):677-80.

4. Patricia Ducy.Rui Zhang.Valérie Geoffroy.Amy L Ridall.Gérard Karsenty.Osf2/Cbfa1: A Transcriptional Activator of Osteoblast Differentiation[J].Cell,1997,89(5):747-754.

5. Masaki Inada.Takenobu Katagiri.Shuichi Akiyama.Mana Namiki.Motohiro Komaki.Akira Yamaguchi.Kyuichi Kamoi.Vicki Rosen.Tatsuo Suda.Bone Morphogenetic Protein-12 and -13 Inhibit Terminal Differentiation of Myoblasts, but Do Not Induce Their Differentiation into Osteoblasts[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,1996,222(2):317-322.

6. Patricia Ducy.Gerard Karsenty.Two distinct osteoblast-specific cis-acting elements control expression of a mouse osteocalcin gene[J].Molecular & Cellular Biology,1995,15(4):.

7. MARION AHRENS.THOMAS ANKENBAUER.DIETMAR SCHR?DER.ANGELA HOLLNAGEL.HUBERT MAYER.GERHARD GROSS.Expression of Human Bone Morphogenetic Proteins-2 or -4 in Murine Mesenchymal Progenitor C3H10T? Cells Induces Differentiation into Distinct Mesenchymal Cell Lineages[J].DNA & Cell Biology,1993,12(10):871~880.

8. E A Wang.V Rosen.J S D'Alessandro.M Bauduy.P Cordes.T Harada.D I Israel.R M Hewick.K M Kerns.P LaPan.Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990,87(6):2220-4.

9. JM Wozney.V Rosen.AJ Celeste.LM Mitsock.MJ Whitters.RW Kriz.RM Hewick.EA Wang.Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities[J].科學(xué)（上海）,1988,242(4885):1528-1534.

10. E A Wang.V Rosen.P Cordes.R M Hewick.M J Kriz.D P Luxenberg.B S Sibley.J M Wozney.Purific