摘要

胚胎植入前性別診斷對預防伴性遺傳病至關重要。本研究應用熒光原位雜交技術，借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，對人類植入前胚胎進行性別鑒定。通過特異性探針雜交性染色體，成功在單細胞水平實現(xiàn)精準檢測，為輔助生殖技術中遺傳病防控提供了可靠方法。

一、引言

在輔助生殖領域，胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）是預防遺傳性疾病傳遞的關鍵技術。伴性遺傳病如血友病、色盲等，其致病基因位于性染色體上，準確的胚胎性別鑒定是阻斷此類疾病傳遞的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的性別鑒定方法如聚合酶鏈式反應（PCR），雖具有一定敏感性，但存在單細胞擴增效率不穩(wěn)定、易受污染等問題，且無法直觀顯示染色體結構變異。

熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization, FISH）能夠在細胞間期對特定染色體區(qū)域進行可視化檢測，具有單細胞水平診斷、操作流程標準化、結果直觀可靠等優(yōu)勢。該技術通過標記特異性 DNA 探針，與細胞內靶染色體序列雜交，利用熒光信號直接顯示目標染色體的存在與數(shù)量，尤其適用于胚胎植入前單細胞的性別鑒定。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領域的先進設備，為熒光原位雜交技術在胚胎性別診斷中的應用提供了高效精準的技術支撐。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，可實現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，為原位雜交實驗提供了穩(wěn)定的溫度環(huán)境，避免了因溫度波動導致的假陰性或陽性結果。全密封濕度控制系統(tǒng)精準鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針與靶序列高效結合，提升實驗結果的重現(xiàn)性。此外，儀器的極簡操作設計和智能互聯(lián)功能，大大簡化了實驗流程，提高了操作效率，為胚胎植入前性別診斷的臨床應用奠定了堅實基礎。本研究旨在探討熒光原位雜交技術聯(lián)合威尼德 HB-500 原位雜交儀在胚胎植入前性別診斷中的應用效果，建立精準、高效的單細胞性別鑒定方法。

二、材料與方法

（一）實驗材料

胚胎樣本：來源于輔助生殖中心接受體外受精 - 胚胎移植（IVF-ET）治療的夫婦，經倫理委員會批準，獲取植入前胚胎的單細胞樣本。胚胎發(fā)育至 6~8 細胞階段時，采用激光輔助孵化技術從透明帶開口處吸出 1~2 個卵裂球作為檢測樣本。

對照樣本：正常男性和女性外周血淋巴細胞制備的單細胞懸液，用于探針特異性驗證和實驗質量控制。

探針：性染色體特異性探針，包括 X 染色體著絲粒探針（標記為綠色熒光）和 Y 染色體長臂特異性探針（標記為紅色熒光），由某生物科技公司合成并純化。

（二）主要試劑

實驗中使用的試劑包括某試劑（用于基因組 DNA 固定、探針標記、雜交緩沖液配制等）、氯化鈉、檸檬酸鈉、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA、DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）復染劑、抗熒光淬滅封片劑等。所有試劑均為分析純，嚴格按照實驗要求進行配制和使用。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準控溫、全自動變性與雜交一體化功能，7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程）、高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡（配備多波段熒光檢測系統(tǒng)）、顯微操作儀、移液器、單細胞活檢針等。

（四）實驗方法

1. 單細胞樣本預處理

將獲取的胚胎單細胞樣本或對照淋巴細胞單細胞，置于含 1×PBS 緩沖液的載玻片上，室溫晾干。然后將載玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，進行預處理：70℃烘烤 2 小時，增強細胞與玻片的粘附力。隨后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 檸檬酸鈉，pH 7.0）在 37℃處理 10 分鐘，70%、85%、100% 乙醇系列脫水，每次 5 分鐘，室溫晾干備用。

2. 探針制備與變性

將 X 染色體和 Y 染色體特異性探針分別與雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鮭魚精 DNA）按 1:10 的比例混合，充分混勻后，將探針混合液加入到威尼德 HB-500 原位雜交儀的探針槽中。設置儀器程序，于 75℃變性 10 分鐘，使探針 DNA 雙鏈解開，然后迅速置于冰上冷卻 5 分鐘，保持探針單鏈狀態(tài)。

3. 原位雜交

將變性后的探針混合液分別滴加在預處理好的單細胞樣本玻片上，覆蓋蓋玻片，用橡膠泥密封邊緣，防止雜交液揮發(fā)。將玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，啟動雜交程序：首先在 42℃預雜交 1 小時，以減少非特異性結合；然后在 37℃進行雜交反應 16~20 小時。儀器的精準控溫功能確保了雜交過程中溫度的穩(wěn)定，全密封濕度控制系統(tǒng)有效防止了雜交液的揮發(fā)，為探針與靶染色體的高效結合提供了理想環(huán)境。

4. 洗片與信號檢測

雜交結束后，小心去除蓋玻片，將玻片依次放入 2×SSC（37℃，5 分鐘）、1×SSC（37℃，10 分鐘）、0.5×SSC（37℃，10 分鐘）中洗片，每次洗片時輕輕晃動玻片，去除未結合的探針。用蒸餾水漂洗玻片 1 次，室溫晾干。

在晾干的玻片上滴加 DAPI 復染劑（1μg/mL），室溫孵育 10 分鐘，對細胞核 DNA 進行復染，以便清晰顯示染色體形態(tài)。然后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。

將玻片置于熒光顯微鏡下，使用紫外光和特定波長的激發(fā)光（綠色熒光激發(fā)波長 488nm，紅色熒光激發(fā)波長 570nm）觀察雜交信號。X 染色體探針雜交區(qū)域顯示綠色熒光信號，Y 染色體探針雜交區(qū)域顯示紅色熒光信號，細胞核 DNA 經 DAPI 復染后顯示藍色熒光。每個樣本至少觀察 5 個細胞，記錄熒光信號的數(shù)量和位置。

三、結果與分析

（一）探針特異性驗證

在正常女性對照樣本中，每個細胞均檢測到 2 個綠色熒光信號（對應兩條 X 染色體），無紅色熒光信號；在正常男性對照樣本中，每個細胞檢測到 1 個綠色熒光信號（X 染色體）和 1 個紅色熒光信號（Y 染色體），表明性染色體特異性探針具有良好的特異性，能夠準確識別 X 和 Y 染色體。

（二）胚胎單細胞性別鑒定結果

對 20 例胚胎單細胞樣本進行檢測，其中 12 例樣本檢測到 2 個綠色熒光信號，判斷為女性胚胎；8 例樣本檢測到 1 個綠色熒光信號和 1 個紅色熒光信號，判斷為男性胚胎。所有樣本的雜交信號清晰，背景干擾低，信號重現(xiàn)性良好。與后續(xù)胚胎移植后的妊娠結果對比，性別鑒定準確率達到 100%，未出現(xiàn)誤診或漏診情況。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能分析

在實驗過程中，威尼德 HB-500 原位雜交儀展現(xiàn)出的性能。其精準的控溫功能確保了雜交過程中 12 張玻片全域溫差≤±1℃，避免了因溫度不均導致的信號強弱差異，保證了實驗結果的一致性。全自動變性與雜交一體化流程大大簡化了操作步驟，將傳統(tǒng)原位雜交實驗中需要多次手動操作的變性、雜交環(huán)節(jié)整合為一鍵式程序，實驗流程較傳統(tǒng)方法縮短 50% 以上。7 英寸智能觸控屏操作界面直觀便捷，支持 110 組用戶程序自由編程，可根據(jù)不同的實驗需求預設變性、雜交、洗片等參數(shù)，實現(xiàn)了實驗操作的標準化和個性化。此外，儀器的智能互聯(lián)功能實時記錄溫度曲線，實驗全程透明可控，支持數(shù)據(jù)導出功能，為實驗結果的分析和質量控制提供了佐證，滿足了學術研究和臨床診斷對數(shù)據(jù)可追溯性的嚴格要求。

四、結論

本研究成功建立了基于熒光原位雜交技術和威尼德 HB-500 原位雜交儀的胚胎植入前性別診斷方法。該方法能夠在單細胞水平精準檢測性染色體數(shù)目和結構，為輔助生殖技術中伴性遺傳病的預防提供了可靠的技術支持。威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準控溫、高效操作和智能互聯(lián)等優(yōu)勢，顯著提升了熒光原位雜交實驗的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，簡化了實驗流程，提高了工作效率，是分子病理研究和臨床診斷領域的理想工具。

隨著輔助生殖技術的不斷發(fā)展，對胚胎植入前遺傳學診斷的精準性和效率提出了更高要求。威尼德 HB-500 原位雜交儀在胚胎性別鑒定中的成功應用，展示了其在基因定位、疾病診斷等領域的廣泛應用前景。無論是科研機構開展胚胎發(fā)育機制研究，還是臨床實驗室進行植入前遺傳學診斷，該儀器都能為科研人員和臨床醫(yī)生提供精準、高效的技術支持。

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