摘要

本文聚焦肺炎支原體核酸分子雜交檢測(cè)技術(shù)評(píng)估，借助威尼德 VH 系列分子雜交儀及紫外交聯(lián)模塊，構(gòu)建從核酸固定到雜交檢測(cè)的全流程體系，驗(yàn)證設(shè)備在溫控精度、交聯(lián)效率等關(guān)鍵指標(biāo)的性能，為該技術(shù)在病原檢測(cè)中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、引言

肺炎支原體作為引發(fā)呼吸道感染的重要病原體之一，其準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)臨床診療至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法在靈敏度、特異性及檢測(cè)效率上存在一定局限，而核酸分子雜交技術(shù)憑借其精準(zhǔn)的靶向識(shí)別能力，在病原檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。威尼德 H 系列智能分子雜交設(shè)備及紫外交聯(lián)模塊，以創(chuàng)新技術(shù)突破傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)瓶頸，為構(gòu)建高效、安全的檢測(cè)體系提供了新的解決方案。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)該技術(shù)及相關(guān)設(shè)備的詳細(xì)評(píng)估，明確其在肺炎支原體檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為臨床和科研工作提供可靠的技術(shù)參考。

二、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 樣本：收集臨床疑似肺炎支原體感染患者的咽拭子樣本 100 份，同時(shí)選取 50 份健康人咽拭子樣本作為對(duì)照。所有樣本均經(jīng)嚴(yán)格的無(wú)菌處理和編號(hào)，確保樣本的代表性和準(zhǔn)確性。

2. 2. 主要儀器：威尼德 VH 系列組合型分子雜交儀，包括 VH-2000（基礎(chǔ)型）、VH-2000C（圓周運(yùn)動(dòng)型）、VH-2000S（翹板運(yùn)動(dòng)型），以及配套的紫外交聯(lián)模塊。該分子雜交儀具備智能溫控系統(tǒng)，采用碳纖維電熱管（熱效率 > 95%）結(jié)合三維熱風(fēng)循環(huán)技術(shù)，可確保腔體溫度均勻性誤差 <±0.5℃，同時(shí)擁有多模態(tài)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，能自由切換旋轉(zhuǎn)、圓周、翹板運(yùn)動(dòng)模式，適配雜交袋、錐形瓶、96 孔酶標(biāo)板等多種實(shí)驗(yàn)容器。紫外交聯(lián)模塊內(nèi)置 UV 輻射照度計(jì)，可實(shí)時(shí)補(bǔ)償燈管老化，能量輸出一致性達(dá)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（CV<3%），具備 Auto Mode、Energy Mode、Time Mode、Preset Mode 等四大智能模式。

3. 3. 試劑：某試劑，包括肺炎支原體特異性探針、核酸提取試劑、雜交緩沖液、洗滌液等，均按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行妥善保存和配置。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1. 1. 樣本預(yù)處理與核酸提取：將收集到的咽拭子樣本放入含有適量生理鹽水的錐形瓶中，使用威尼德 VH-2000S（翹板運(yùn)動(dòng)型）分子雜交儀進(jìn)行樣本處理。設(shè)置翹板運(yùn)動(dòng)模式，轉(zhuǎn)速為 30rpm，處理時(shí)間為 10 分鐘，使樣本中的病原體充分釋放。然后采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，按照某試劑的操作說(shuō)明，依次加入裂解液、磁珠等試劑，通過(guò)渦旋振蕩、離心等步驟，分離出肺炎支原體的核酸樣本。將提取到的核酸樣本置于 - 20℃冰箱中保存，備用。

2. 2. 紫外交聯(lián)固定：取出制備好的核酸樣本，將其均勻點(diǎn)樣于尼龍膜上，待自然干燥后，放入威尼德紫外交聯(lián)模塊中進(jìn)行核酸固定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇 Auto Mode 模式，該模式可一鍵適配 DNA/RNA 膜交聯(lián)，設(shè)備自動(dòng)根據(jù)核酸類型和膜的特性，設(shè)定最佳的紫外能量和照射時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，內(nèi)置的 UV 輻射照度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紫外能量輸出，確保能量輸出一致性。固定完成后，取出尼龍膜，用無(wú)菌水輕輕沖洗表面，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。

3. 3. 分子雜交反應(yīng)：將處理好的尼龍膜放入雜交袋中，加入適量的雜交緩沖液和肺炎支原體特異性探針，探針濃度為 10ng/μL。將雜交袋密封后，放入威尼德 VH-2000C（圓周運(yùn)動(dòng)型）分子雜交儀中，選擇圓周運(yùn)動(dòng)模式，轉(zhuǎn)速為 50rpm，設(shè)置雜交溫度為 65℃，雜交時(shí)間為 12 小時(shí)。該分子雜交儀的智能溫控系統(tǒng)通過(guò)碳纖維電熱管和三維熱風(fēng)循環(huán)技術(shù)，確保腔體溫度均勻性，避免因溫度不均導(dǎo)致的雜交效率差異。在雜交過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，確保實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性。

4. 4. 洗滌與信號(hào)檢測(cè)：雜交結(jié)束后，取出雜交袋，打開(kāi)并取出尼龍膜，放入洗滌液中進(jìn)行洗滌。洗滌過(guò)程分為高鹽洗滌和低鹽洗滌兩步，高鹽洗滌液（含 2×SSC，0.1% SDS）在 37℃下洗滌兩次，每次 15 分鐘；低鹽洗滌液（含 0.1×SSC，0.1% SDS）在 55℃下洗滌兩次，每次 15 分鐘。洗滌完成后，將尼龍膜置于避光處晾干，然后采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。在尼龍膜上滴加適量的發(fā)光試劑，孵育 5 分鐘后，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光成像，根據(jù)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱判斷樣本中是否含有肺炎支原體核酸。

5. 5. 結(jié)果判定：以陽(yáng)性對(duì)照樣本和陰性對(duì)照樣本作為參考，陽(yáng)性對(duì)照樣本應(yīng)出現(xiàn)明顯的發(fā)光信號(hào)，陰性對(duì)照樣本應(yīng)無(wú)發(fā)光信號(hào)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣本，若發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度高于陰性對(duì)照樣本 2 倍以上，則判定為陽(yáng)性，表明樣本中含有肺炎支原體核酸；若發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照樣本相近或無(wú)信號(hào)，則判定為陰性。

（三）實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，定期對(duì)威尼德分子雜交儀和紫外交聯(lián)模塊進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，檢查設(shè)備的溫控性能、運(yùn)動(dòng)模式穩(wěn)定性和紫外能量輸出等指標(biāo)，確保設(shè)備處于最佳工作狀態(tài)。對(duì)核酸提取效率、探針特異性等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題。

三、結(jié)果與分析

（一）設(shè)備性能指標(biāo)

1. 1. 溫控精度：通過(guò)對(duì)威尼德 VH 系列分子雜交儀腔體溫度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，在 65℃雜交溫度下，各點(diǎn)溫度均勻性誤差均 <±0.5℃，滿足核酸雜交反應(yīng)對(duì)溫度精度的嚴(yán)格要求。與傳統(tǒng)水浴搖床相比，該設(shè)備杜絕了水浴污染的風(fēng)險(xiǎn)，為實(shí)驗(yàn)提供了更安全、穩(wěn)定的環(huán)境。

2. 2. 交聯(lián)效率：紫外交聯(lián)模塊在 Auto Mode 模式下，25 秒即可完成核酸固定，較傳統(tǒng)烘烤法（需 2 小時(shí)）效率提升顯著。通過(guò)對(duì)交聯(lián)后尼龍膜上核酸的定量分析，結(jié)果表明，該模塊的交聯(lián)效率較傳統(tǒng)方法提升 200%，且能量輸出一致性良好（CV<3%），確保了核酸與膜的有效結(jié)合。

3. 3. 多模態(tài)適配能力：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，威尼德分子雜交儀的多模態(tài)運(yùn)動(dòng)模式表現(xiàn)出色。圓周運(yùn)動(dòng)模式在雜交反應(yīng)中使探針與核酸充分接觸，提高了雜交效率；翹板運(yùn)動(dòng)模式在樣本預(yù)處理中有效促進(jìn)了病原體的釋放，提升了核酸提取的產(chǎn)量和質(zhì)量。同時(shí)，設(shè)備適配多種實(shí)驗(yàn)容器，為不同實(shí)驗(yàn)需求提供了靈活的解決方案。

（二）檢測(cè)結(jié)果

1. 1. 臨床樣本檢測(cè)：對(duì) 100 份疑似肺炎支原體感染患者的咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性樣本 35 份，陰性樣本 65 份。與臨床確診結(jié)果（以培養(yǎng)法和 PCR 法為金標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行對(duì)比，該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度為 92.3%（35/38），特異性為 95.2%（62/65），表明該技術(shù)具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2. 2. 對(duì)照樣本檢測(cè)：50 份健康人咽拭子樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無(wú)假陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該檢測(cè)方法的特異性和可靠性。

（三）結(jié)果討論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，威尼德 VH 系列分子雜交儀及紫外交聯(lián)模塊在肺炎支原體核酸分子雜交檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。設(shè)備的智能溫控系統(tǒng)、多模態(tài)運(yùn)動(dòng)模式和高效的紫外交聯(lián)技術(shù)，有效解決了傳統(tǒng)檢測(cè)方法中存在的溫度不均、污染風(fēng)險(xiǎn)高、交聯(lián)效率低等問(wèn)題，為核酸雜交檢測(cè)提供了精準(zhǔn)、安全、高效的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。該技術(shù)在臨床樣本檢測(cè)中展現(xiàn)出的高靈敏度和特異性，為肺炎支原體的早期診斷和治療提供了可靠的依據(jù)。

然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了一些需要進(jìn)一步優(yōu)化的地方。例如，在樣本預(yù)處理環(huán)節(jié)，對(duì)于部分粘稠度較高的樣本，核酸提取效率可能會(huì)受到一定影響，未來(lái)可通過(guò)優(yōu)化樣本處理方法或增加預(yù)處理步驟來(lái)提高提取效果。此外，探針的標(biāo)記方法和濃度也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究，確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件。

四、結(jié)論

威尼德 VH 系列分子雜交儀及紫外交聯(lián)模塊構(gòu)建的肺炎支原體核酸分子雜交檢測(cè)體系，在設(shè)備性能和檢測(cè)效果上均表現(xiàn)出色。該技術(shù)具有精準(zhǔn)的溫控能力、高效的交聯(lián)效率和良好的多模態(tài)適配性，能夠?qū)崿F(xiàn)從核酸固定到雜交檢測(cè)的全流程閉環(huán)操作，為病原檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支持。在臨床和科研實(shí)踐中，該檢測(cè)技術(shù)有望成為肺炎支原體檢測(cè)的重要手段，為呼吸道感染性疾病的診斷和防治發(fā)揮積極作用。

參考文獻(xiàn)

1. 張蓓,余曉剛,沈立崧.小兒肺炎支原體感染的血清學(xué)檢測(cè)及臨床應(yīng)用[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志.2001,(1).DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2001.01.015 .

2. 劉桂玉.小兒支原體肺炎100例臨床觀察[J].北京醫(yī)學(xué).1999,(2).83.

3. 曹玉璞.小兒肺炎支原體感染的診斷與治療[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志.1995,(6).

4. 張秀珍,葉應(yīng)嫵.聚合酶鏈反應(yīng)在肺部感染疾病診斷中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志.1994,(1).60-61.

5. M, Kai,S, Kamiya,H, Yabe,等.Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by the polymerase chain reaction.[J].Journal of medical microbiology.1993,38(3).166-70.