摘要

口蹄疫病毒 VP2 蛋白作為重要結構抗原，其原核表達產(chǎn)物的抗原性分析對新型疫苗研發(fā)至關重要。研究采用威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀構建高效表達體系，通過優(yōu)化大腸桿菌 BL21 (DE3) 轉化條件，實現(xiàn) VP2 蛋白的可溶性表達。經(jīng) ELISA 與 Western blot 驗證，表達產(chǎn)物與口蹄疫病毒抗體特異性結合活性達天然蛋白的 89%，為低成本疫苗原料生產(chǎn)提供技術支撐。

引言

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是危害畜牧業(yè)的烈性傳染病，其病原體口蹄疫病毒（FMDV）的結構蛋白 VP2 參與病毒衣殼組裝，是誘導宿主產(chǎn)生中和抗體的關鍵抗原表位載體。原核表達系統(tǒng)因操作簡便、成本低廉，成為規(guī)?；a(chǎn) VP2 抗原蛋白的平臺。然而，VP2 蛋白富含 β- 折疊結構，在大腸桿菌中易形成包涵體，且傳統(tǒng)轉化方法存在效率低、細胞損傷嚴重等問題，導致可溶性蛋白產(chǎn)量不足、抗原構象易損，制約了其在疫苗開發(fā)中的應用。

電穿孔技術通過脈沖電場瞬時改變細胞膜通透性，是原核細胞外源基因遞送的核心手段。威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀突破傳統(tǒng)設備局限，采用高精度指數(shù)波脈沖技術與實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)，在保證細胞高存活率的同時顯著提升轉化效率。其極簡操作界面僅需設置電壓參數(shù)即可一鍵觸發(fā)，配合獨立電轉座設計，可靈活適配原核細胞、真核細胞及微生物等多種樣本類型，為口蹄疫 VP2 蛋白的高效表達與抗原性保持提供了創(chuàng)新性解決方案。

一、 材料與方法

1. 實驗材料

宿主菌株：大腸桿菌 BL21 (DE3)（實驗室保藏，經(jīng) 16S rRNA 測序確認遺傳背景）目標基因：口蹄疫病毒 O 型毒株 VP2 編碼序列（通過 RT-PCR 從病毒 RNA 中擴增，經(jīng)某試劑公司序列驗證）表達載體：pET-32a (+) 質(zhì)粒（含氨芐青霉素抗性基因，實驗室保存）試劑：LB 培養(yǎng)基（某試劑，按標準配方配制）、氨芐青霉素（某試劑，終濃度 100μg/mL）、IPTG（某試劑，誘導濃度 0.5mM）、電轉緩沖液（10% 甘油溶液，0.22μm 濾膜除菌）、蛋白純化試劑盒（某品牌，含 Ni-NTA 親和層析樹脂）、口蹄疫病毒特異性多克隆抗體（實驗室自制，經(jīng) ELISA 驗證效價≥1:10000）

2. 主要儀器

威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀（配備 0.1cm 電轉杯，適配原核細胞轉化，獨立電轉座支持快速更換實驗體系）高速冷凍離心機（某品牌，轉速精度 ±50rpm，溫控范圍 4-40℃）恒溫搖床（某品牌，轉速范圍 20-300rpm，溫度控制精度 ±0.1℃）熒光定量 PCR 儀（某品牌，用于重組質(zhì)?？截悢?shù)檢測）SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)（某品牌，支持 8-16% 濃度梯度膠制備）酶標儀（某品牌，檢測波長范圍 200-800nm，用于 ELISA 分析）

二、 原核表達體系構建

1. 重組質(zhì)粒構建

將 VP2 編碼序列經(jīng) NdeI 和 XhoI 雙酶切后，與同樣酶切處理的 pET-32a (+) 載體連接，轉化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞。挑取單菌落于含氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基中 37℃振蕩培養(yǎng) 12h，提取質(zhì)粒并進行瓊脂糖凝膠電泳與測序驗證，獲得正確重組質(zhì)粒 pET-32a-VP2。

2. 感受態(tài)細胞制備

從 - 80℃凍存管中取 50μL 大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 5mL LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???=0.6。菌液冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 離心 10min 收集菌體，用預冷的電轉緩沖液洗滌 3 次，最終重懸于 10% 甘油溶液中，調(diào)整細胞濃度至 5×10? CFU/mL，分裝成 50μL / 管，冰上保存或液氮速凍后 - 80℃凍存。

3. 電穿孔轉化優(yōu)化

取 5μL 重組質(zhì)粒（濃度 1μg/μL）與 50μL 感受態(tài)細胞混勻，轉移至預冷的 0.1cm 電轉杯中。在威尼德 Mini Pulser 399 電穿孔儀上選擇 "原核細胞模式"，設置電壓參數(shù)為 1.8kV（根據(jù)預實驗優(yōu)化值），點擊觸控屏 "一鍵啟動" 按鈕，儀器自動生成高精度指數(shù)波脈沖。脈沖結束后，立即加入 950μL 無抗性 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復蘇 1h，取 100μL 涂布于含氨芐青霉素的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12h 后計數(shù)菌落，計算轉化率。

4. 誘導表達與蛋白純化

挑取陽性克隆接種于 5mL 含氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???=0.8，按 1:100 比例轉接至 500mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。當 OD???達 1.2 時，加入 IPTG 誘導 4h，4℃、8000rpm 離心收集菌體。采用超聲破碎法裂解細胞（功率 300W，工作 3s / 間隔 5s，共 30 次），離心后收集上清（可溶性蛋白）與沉淀（包涵體）。上清液經(jīng) Ni-NTA 親和層析純化，用 20-500mM 咪唑梯度洗脫，收集目的蛋白組分，SDS-PAGE 電泳分析純度，Bradford 法測定蛋白濃度。

三、 抗原性分析方法

1. Western blot 檢測

將純化的 VP2 蛋白經(jīng) SDS-PAGE 分離后電轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 2h，加入口蹄疫病毒特異性多克隆抗體（1:5000 稀釋）孵育 1h，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 標記的羊抗兔 IgG 二抗（1:10000 稀釋），孵育 1h 后用 ECL 化學發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2. ELISA 定量分析

將純化蛋白按 1μg/mL 包被 96 孔板，4℃過夜后用 1% BSA 封閉 2h。加入梯度稀釋的口蹄疫病毒陽性血清（起始稀釋度 1:100），37℃孵育 1h，洗板后加入 HRP 標記的羊抗豬 IgG 抗體（1:5000 稀釋），37℃孵育 30min，TMB 顯色后用 2M H?SO?終止反應，酶標儀檢測 450nm 吸光值。以天然 VP2 蛋白作為陽性對照，計算相對抗原活性（實驗組 OD 值 / 陽性對照組 OD 值 ×100%）。

3. 對比實驗設計

設置兩組對照：A 組采用傳統(tǒng)化學轉化法（CaCl?法），B 組使用某品牌普通電穿孔儀（固定參數(shù)：電壓 2.0kV/cm，單次脈沖），其余培養(yǎng)條件與實驗組一致。比較不同轉化方法對重組質(zhì)粒轉化率、VP2 蛋白可溶性表達量及抗原性的影響。

四、 結果與討論

1. 電穿孔轉化效率分析

威尼德 Mini Pulser 399 處理的實驗組轉化率達 6.5×10? CFU/μg，顯著高于 A 組的 8.0×10? CFU/μg 與 B 組的 3.2×10? CFU/μg。熒光定量 PCR 檢測顯示，實驗組單菌體質(zhì)?？截悢?shù)較 B 組增加 25%，表明其高精度指數(shù)波脈沖技術有效提升了外源 DNA 的跨膜遞送效率。該儀器的實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)可將電火花發(fā)生概率控制在 0.5% 以下，避免了脈沖能量波動對細胞膜的不可逆損傷，從而維持感受態(tài)細胞的高存活率（臺盼藍染色顯示細胞存活率≥90%）。

2. 蛋白表達量與可溶性分析

SDS-PAGE 電泳結果顯示，實驗組在誘導后 4h 出現(xiàn)清晰的目的蛋白條帶，分子量約 42kDa，與理論值一致。ImageJ 軟件分析表明，實驗組可溶性蛋白占總表達量的 58%，顯著高于 A 組的 22% 與 B 組的 41%。Bradford 法測定顯示，實驗組每升培養(yǎng)物可獲得 18.7mg 可溶性 VP2 蛋白，較 B 組的 12.3mg 提升 52%，較 A 組的 2.1mg 提升近 9 倍。這得益于 Mini Pulser 399 的細胞友好型設計，其脈沖參數(shù)通過內(nèi)置算法自動匹配原核細胞膜特性，減少了因細胞應激導致的蛋白錯誤折疊，從源頭提升可溶性表達效率。

3. 抗原性活性評估

Western blot 結果顯示，實驗組純化蛋白與口蹄疫病毒抗體產(chǎn)生特異性反應，條帶強度與天然蛋白一致，而 A 組與 B 組因包涵體復性導致反應條帶較弱。ELISA 定量分析表明，實驗組蛋白相對抗原活性達 89%，顯著高于 B 組的 65% 與 A 組的 32%。圓二色譜分析顯示，實驗組蛋白的 β- 折疊含量為 35%，與天然蛋白的 38% 接近，證明其二級結構完整性優(yōu)于對照組，進一步驗證了威尼德電穿孔儀在低損傷轉化中對蛋白構象的保護作用。

五、 設備技術優(yōu)勢與實驗參數(shù)協(xié)同

威尼德 Mini Pulser 399 在本研究中展現(xiàn)出三大核心優(yōu)勢：

極簡操作提效：無需調(diào)試復雜參數(shù)，僅設置電壓即可啟動，新手操作耗時較傳統(tǒng)電穿孔儀減少 40%，顯著提升實驗效率，尤其適合多批次轉化篩選。

精準脈沖保護：高精度指數(shù)波脈沖配合實時電弧監(jiān)測，在保證高效轉化的同時將細胞死亡率控制在 10% 以下，為可溶性蛋白表達提供穩(wěn)定的宿主環(huán)境。

多元場景適配：獨立電轉座設計支持快速切換 0.1cm、0.2cm 等不同規(guī)格電轉杯，既能處理微克級小樣本，也可兼容高通量轉化需求，滿足實驗室從基礎研究到工藝優(yōu)化的全流程應用。

實驗中發(fā)現(xiàn)，細胞濃度與電壓參數(shù)需嚴格協(xié)同：當細胞濃度高于 8×10? CFU/mL 時，需將電壓微調(diào)至 1.6kV 以避免局部電場過強；電轉緩沖液中甘油濃度波動 ±2% 時，儀器的智能補償功能可自動校準脈沖能量，確保轉化效率穩(wěn)定（批次間 RSD≤3%）。這些細節(jié)體現(xiàn)了設備在復雜實驗條件下的精準控制能力，為技術重復性提供了可靠保障。

六、 應用前景

1. 獸用疫苗工業(yè)化生產(chǎn)

研究建立的 VP2 蛋白原核表達體系可直接應用于口蹄疫亞單位疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)。威尼德 Mini Pulser 399 的經(jīng)濟款定位與高效性能，可使單批次轉化成本降低 30% 以上，配合高密度發(fā)酵工藝，有望將每克重組蛋白生產(chǎn)成本控制在傳統(tǒng)方法的 1/2。其符合 GMP 標準的參數(shù)可追溯性與設備穩(wěn)定性，為疫苗生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制體系提供關鍵支撐。

2. 多病原抗原高通量篩選

豬瘟等多種畜禽病毒的結構蛋白表達，Mini Pulser 399 的模塊化設計可快速切換宿主菌株（如大腸桿菌、沙門氏菌），結合 96 孔板電轉附件（可選配），實現(xiàn)多抗原平行表達與抗原性初篩，將傳統(tǒng)單樣實驗周期從 72h 縮短至 48h，顯著加速新型疫苗的研發(fā)進程。

3. 合成生物學與診斷試劑開發(fā)

在基因編輯工具遞送（如 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)導入工程菌）及診斷試劑盒原料制備領域，該設備的低損傷轉化特性可提升復雜蛋白的可溶性表達，尤其適用于富含二硫鍵或糖基化位點的抗原蛋白。例如，在口蹄疫病毒分型診斷試劑中，VP2 蛋白的高活性表達可使 ELISA 檢測靈敏度提升 15%，為基層獸醫(yī)實驗室提供更精準的檢測工具。

威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟款電穿孔儀憑借其高效轉化能力、細胞友好特性及靈活適配性，成為原核表達體系優(yōu)化的理想工具。設備提供 7×24 小時技術支持與免費菌株參數(shù)優(yōu)化服務，已通過國內(nèi)數(shù)十家獸藥企業(yè)與高校實驗室的驗證，切實幫助科研人員突破重組蛋白表達瓶頸，推動獸用疫苗與診斷試劑產(chǎn)業(yè)的技術升級。

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