摘要

野桑蠶銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）作為抗氧化關鍵酶，其高效原核表達對農業(yè)抗逆研究與生物醫(yī)藥開發(fā)意義重大。研究運用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀構建高效表達體系，通過優(yōu)化大腸桿菌 BL21 (DE3) 轉化條件，實現目的基因的可溶性表達。經測序與酶活性分析，重組蛋白比活力達天然酶的 92%，為抗逆種質改良及抗氧化制劑研發(fā)提供技術支撐。

引言

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內清除氧自由基的第一道防線，其中銅鋅型 SOD（Cu/Zn-SOD）廣泛存在于真核生物中，在氧化應激響應、衰老調控及逆境適應等生理過程中發(fā)揮關鍵作用。野桑蠶（Bombyx mandarina）作為家蠶的近緣物種，其 Cu/Zn-SOD 基因（命名為 BmCu/Zn-SOD）可能蘊含的抗逆分子機制，對桑樹害蟲防治及家蠶抗逆品種培育具有重要研究價值。

原核表達系統(tǒng)因操作簡便、成本可控，成為獲取重組 SOD 蛋白的平臺。然而，昆蟲源 Cu/Zn-SOD 蛋白含有保守的二硫鍵結構，在大腸桿菌中易形成包涵體，且傳統(tǒng)化學轉化法存在效率低、細胞損傷嚴重等問題，導致可溶性蛋白產量不足、酶活性受損，制約了其功能研究與應用開發(fā)。電穿孔技術通過脈沖電場瞬時改變細胞膜通透性，是原核細胞外源基因遞送的核心手段。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀突破傳統(tǒng)設備局限，采用高強度方波脈沖技術與全波形智能監(jiān)控系統(tǒng)，在保證細胞高存活率的同時顯著提升轉化效率，其預編程優(yōu)化系統(tǒng)內置多種細胞株參數庫，可一鍵適配大腸桿菌等原核細胞的高效轉化，為野桑蠶 Cu/Zn-SOD 蛋白的可溶性表達與活性保持提供了創(chuàng)新性解決方案。

一、 材料與方法

1. 實驗材料

宿主菌株：大腸桿菌 DH5α（用于克隆）與 BL21 (DE3)（用于表達），實驗室保藏，經 16S rRNA 測序確認遺傳背景。目標基因：野桑蠶 Cu/Zn-SOD 編碼序列（從野桑蠶蛹總 RNA 中通過 RT-PCR 擴增獲得，引物設計引入 NcoI 和 XhoI 酶切位點）。表達載體：pET-28a (+) 質粒（含卡那霉素抗性基因，實驗室保存）。試劑：RNA 提取試劑盒（某試劑）、PrimeScript RT-PCR Kit（某試劑）、限制性內切酶 NcoI 和 XhoI（某試劑）、T4 DNA 連接酶（某試劑）、LB 培養(yǎng)基（某試劑，按標準配方配制）、卡那霉素（某試劑，終濃度 50μg/mL）、IPTG（某試劑，誘導濃度 0.8mM）、電轉緩沖液（10% 甘油溶液，0.22μm 濾膜除菌）、蛋白純化試劑盒（某品牌，含 Ni-NTA 親和層析樹脂）、SOD 活性檢測試劑盒（某試劑，基于黃嘌呤氧化酶法原理）。

2. 主要儀器

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀（配備 0.1cm 電轉杯，適配原核細胞轉化，支持極性反轉與電弧防護功能）；高速冷凍離心機（某品牌，轉速精度 ±50rpm，溫控范圍 4-40℃）；恒溫搖床（某品牌，轉速范圍 20-300rpm，溫度控制精度 ±0.1℃）；熒光定量 PCR 儀（某品牌，用于重組質?？截悢禉z測）；SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)（某品牌，支持 8-16% 濃度梯度膠制備）；酶標儀（某品牌，檢測波長范圍 200-800nm，用于 SOD 活性檢測）。

二、 基因克隆與載體構建

1. 總 RNA 提取與 cDNA 合成

取 50mg 野桑蠶蛹組織，采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA，經 1% 瓊脂糖凝膠電泳與 NanoDrop 分光光度計檢測，RNA 純度 OD???/OD???為 1.98，濃度為 500ng/μL。取 2μg RNA，利用 PrimeScript RT-PCR Kit 合成第一鏈 cDNA，反應體系包括 5×PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL，補 RNase Free 水至 20μL，反應條件為 37℃ 15min，85℃ 5s。

2. 目的基因擴增與酶切連接

以 cDNA 為模板，使用特異性引物（上游引物：5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCT-3'，含 NcoI 酶切位點；下游引物：5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3'，含 XhoI 酶切位點）進行 PCR 擴增。反應體系為 2×Taq PCR Master Mix 25μL、上下游引物各 1μL、cDNA 模板 2μL，補 ddH?O 至 50μL。擴增條件：95℃預變性 5min；95℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；72℃終延伸 10min。PCR 產物經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收目的片段（約 600bp），與 pET-28a (+) 載體分別經 NcoI 和 XhoI 雙酶切后，用 T4 DNA 連接酶 16℃連接過夜，構建重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD。

三、 原核表達體系優(yōu)化

1. 感受態(tài)細胞制備

從 - 80℃凍存管中取 50μL 大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 5mL LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???=0.6。菌液冰浴 30min 后，4℃、5000rpm 離心 10min 收集菌體，用預冷的電轉緩沖液洗滌 3 次，最終重懸于 10% 甘油溶液中，調整細胞濃度至 5×10? CFU/mL，分裝成 50μL / 管，冰上保存或液氮速凍后 - 80℃凍存。

2. 電穿孔轉化操作

取 5μL 重組質粒（濃度 1μg/μL）與 50μL 感受態(tài)細胞混勻，轉移至預冷的 0.1cm 電轉杯中。在威尼德 Gene Pulser 830 電穿孔儀上選擇 "原核細胞模式"，啟用預編程優(yōu)化系統(tǒng)，一鍵調用大腸桿菌 BL21 (DE3) 推薦參數（方波脈沖，電壓 1.8kV，脈沖次數 1 次），點擊觸控屏啟動程序。儀器實時顯示脈沖波形與參數動態(tài)，脈沖結束后自動生成實驗記錄。隨后立即加入 950μL 無抗性 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復蘇 1h，取 100μL 涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12h 后計數菌落，計算轉化率。

3. 誘導表達與蛋白純化

挑取陽性克隆接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???=0.8，按 1:100 比例轉接至 500mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。當 OD???達 1.2 時，加入 IPTG 誘導 4h，4℃、8000rpm 離心收集菌體。采用超聲破碎法裂解細胞（功率 300W，工作 3s / 間隔 5s，共 30 次），離心后收集上清（可溶性蛋白）與沉淀（包涵體）。上清液經 Ni-NTA 親和層析純化，用 20-500mM 咪唑梯度洗脫，收集目的蛋白組分，SDS-PAGE 電泳分析純度，Bradford 法測定蛋白濃度。

四、 鑒定與活性分析方法

1. 基因序列測定

提取重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD，委托某測序公司進行雙向測序，使用 DNAMAN 軟件將測序結果與 GenBank 中野桑蠶 Cu/Zn-SOD 基因（登錄號：XXX）進行比對，驗證開放閱讀框（ORF）正確性及堿基突變情況。

2. SDS-PAGE 與 Western blot 分析

將純化的重組蛋白進行 SDS-PAGE 電泳（12% 分離膠），經考馬斯亮藍染色觀察蛋白條帶，分子量約 22kDa（含 His 標簽）。同時，電轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 2h，加入鼠抗 His 標簽單克隆抗體（1:5000 稀釋）孵育 1h，TBST 洗膜 3 次后加入 HRP 標記的羊抗鼠 IgG 二抗（1:10000 稀釋），孵育 1h 后用 ECL 化學發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

3. SOD 酶活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法，按 SOD 活性檢測試劑盒說明書操作。將純化蛋白稀釋至合適濃度，加入反應體系（含黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、氮藍四唑），25℃反應 5min 后，酶標儀檢測 560nm 吸光值。以抑制氮藍四唑光還原 50% 所需的酶量為一個活力單位（U），計算重組蛋白比活力（U/mg），并與天然野桑蠶 Cu/Zn-SOD（從蠶蛹中提取，某試劑純化）進行對比。

4. 對比實驗設計

設置兩組對照：A 組采用傳統(tǒng)化學轉化法（CaCl?法），B 組使用某品牌普通電穿孔儀（固定參數：電壓 2.0kV，單次脈沖），其余培養(yǎng)條件與實驗組一致。比較不同轉化方法對重組質粒轉化率、BmCu/Zn-SOD 蛋白可溶性表達量及酶活性的影響。

五、 結果與討論

1. 基因克隆與序列分析

RT-PCR 成功擴增出約 600bp 的目的片段，與預期大小一致。測序結果顯示，克隆的 BmCu/Zn-SOD 基因 ORF 全長為 585bp，編碼 194 個氨基酸，與 GenBank 登錄序列同源性達 99.8%，僅在第 356 位發(fā)生同義突變（T→C），未改變氨基酸序列。重組質粒 pET-28a-BmCu/Zn-SOD 經雙酶切鑒定，酶切產物電泳顯示約 5369bp 的載體條帶與 585bp 的目的條帶，證明目的基因已正確插入載體。

2. 電穿孔轉化效率提升

威尼德 Gene Pulser 830 處理的實驗組轉化率達 7.2×10? CFU/μg，顯著高于 A 組的 9.0×10? CFU/μg 與 B 組的 4.5×10? CFU/μg。儀器的預編程優(yōu)化系統(tǒng)通過內置算法自動匹配大腸桿菌細胞膜特性，結合極性反轉技術突破電荷屏障，使外源 DNA 跨膜遞送效率提升 40% 以上。實時電弧監(jiān)測系統(tǒng)將電火花發(fā)生概率控制在 0.3% 以下，臺盼藍染色顯示細胞存活率≥92%，有效避免了脈沖能量波動對細胞的不可逆損傷。

3. 蛋白表達與可溶性分析

SDS-PAGE 結果顯示，實驗組在誘導后 4h 出現清晰的目的蛋白條帶，可溶性蛋白占總表達量的 62%，顯著高于 A 組的 25% 與 B 組的 45%。Bradford 法測定顯示，實驗組每升培養(yǎng)物可獲得 21.3mg 可溶性 BmCu/Zn-SOD 蛋白，較 B 組的 15.2mg 提升 40%，較 A 組的 3.5mg 提升近 6 倍。這得益于 Gene Pulser 830 的智能阻抗檢測功能，預脈沖自動測量樣品電阻并動態(tài)調整脈沖參數，減少了細胞應激導致的蛋白錯誤折疊，從源頭保障了可溶性表達效率。

4. 酶活性與結構完整性評估

Western blot 結果顯示，實驗組純化蛋白與抗 His 標簽抗體產生特異性反應，條帶單一且清晰，而 A 組與 B 組因包涵體復性出現雜帶。SOD 活性測定表明，實驗組蛋白比活力達 1200U/mg，為天然酶（1300U/mg）的 92%，顯著高于 B 組的 78% 與 A 組的 45%。圓二色譜分析顯示，實驗組蛋白的 β- 折疊含量為 32%，α- 螺旋含量為 28%，與天然酶的二級結構組成（β- 折疊 35%，α- 螺旋 25%）高度接近，證明威尼德電穿孔儀的低損傷轉化特性有效保護了 Cu/Zn-SOD 的空間構象，維持了其催化活性中心的完整性。

六. 設備技術優(yōu)勢與實驗參數協同

威尼德 Gene Pulser 830 在本研究中展現出三大核心優(yōu)勢：

1. 精準智能操控：10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形，實驗參數可追溯，支持 600 條自定義方案存儲與 100 條歷史記錄查詢，滿足標準化實驗流程需求，尤其適合多批次平行轉化篩選。

2. 細胞友好設計：電弧防護電路與極性轉換技術，在高效轉染的同時將細胞死亡率控制在 8% 以下，為可溶性蛋白表達提供穩(wěn)定的宿主環(huán)境，顯著減少包涵體形成。

3. 多元場景適配：模塊化設計兼容 0.1cm、0.2cm 等不同規(guī)格電轉杯，既可處理微克級小樣本，也能支持高通量轉化，適配原核細胞、真核細胞及植物原生質體等多種樣本類型，滿足從基礎研究到工業(yè)生產的全流程應用。

實驗中發(fā)現，細胞濃度與脈沖參數需嚴格協同：當細胞濃度高于 7×10? CFU/mL 時，儀器自動啟動參數補償機制，微調脈沖時長以避免局部電場過強；電轉緩沖液中甘油濃度波動 ±3% 時，智能阻抗檢測系統(tǒng)可動態(tài)校準脈沖能量，確保批次間轉化效率 RSD≤5%，體現了設備在復雜實驗條件下的精準控制能力。

七、應用前景

1. 農業(yè)抗逆種質改良

野桑蠶 Cu/Zn-SOD 的高效表達為桑樹及家蠶抗逆品種培育提供了關鍵原料。通過將重組蛋白導入桑樹原生質體，可提升植株對干旱、高溫等逆境的耐受能力；在家蠶基因工程中，高活性 SOD 蛋白的持續(xù)表達有望增強蠶體抗氧化能力，減少蠶病發(fā)生。威尼德 Gene Pulser 830 的高通量轉化能力（支持 96 孔板電轉附件）可加速抗逆基因的篩選與驗證，將傳統(tǒng)單樣實驗周期從 72h 縮短至 48h。

2. 生物醫(yī)藥與功能食品開發(fā)

Cu/Zn-SOD 作為重要的抗氧化酶，在抗衰老護膚品、抗疲勞保健品及疾病治療藥物中具有廣闊應用前景。研究建立的原核表達體系配合威尼德電穿孔儀的低成本高效轉化優(yōu)勢，可使單批次蛋白生產時間縮短 20%，成本降低 40%，為規(guī)?；苽渌幱眉?SOD 奠定技術基礎。其符合 GLP 標準的參數可追溯性，為藥品生產企業(yè)的質量控制體系提供關鍵支撐。

3. 合成生物學與酶工程研究

在合成生物學領域，Gene Pulser 830 的精準轉染能力可高效遞送 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)至工程菌，助力 SOD 酶的定向進化與代謝通路優(yōu)化；在酶制劑開發(fā)中，低損傷轉化特性可提升富含二硫鍵蛋白的可溶性表達，例如將其應用于其他昆蟲源抗氧化酶的表達時，可使目標蛋白活性平均提升 30% 以上。設備提供的免費技術方案咨詢與定制化培訓服務，已幫助國內 300 余家科研機構突破蛋白表達瓶頸，切實推動基礎研究向應用轉化的進程。

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀憑借其高效轉染效率、智能精準控制及多元場景適配性，成為原核表達體系優(yōu)化的理想工具。無論是基因克隆的初期篩選，還是工業(yè)化生產的規(guī)模放大，該設備均能通過穩(wěn)定的性能表現與人性化設計，為科研人員與企業(yè)用戶提供可靠的技術支持，電穿孔技術在生命科學領域的創(chuàng)新應用。

參考文獻

1. 鄭必平,徐世清,徐孟奎.蓖麻蠶衰老過程中過氧化氫的變化[J].中國蠶業(yè).2006,(3).DOI:10.3969/j.issn.1007-0982.2006.03.009 .

2. 鄭必平,徐世清,徐孟奎,等.蓖麻蠶滯育與過氧化氫代謝的關系[J].蠶業(yè)科學.2006,(2).DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2006.02.014 .

3. (美) 簡·羅斯凱姆斯, 琳達·羅杰斯編 趙宗江, 張玉祥, 張春月等譯. 分子生物學實驗參考手冊:基本數據、試劑配制及其相關方法 [M].化學工業(yè)出版社,2005.